LL-37

Przegląd

Skąd pochodzi i dlaczego powstał

LL-37 nie jest peptydem „projektowanym” w ścisłym sensie. Jest to fragment ludzkiej cząsteczki immunologicznej, którą każdy z nas nosi w każdym neutrofilu, w każdej skórze, w każdej wyściółce nabłonkowej. Z tego powodu jego pierwotna charakteryzacja nie rozpoczęła się w laboratorium projektowania komputerowego, lecz we krwi.

W 1995 r. duński zespół pod kierunkiem Ole Sørensena (Rigshospitalet, Kopenhaga) wyizolował z ludzkich neutrofili cząsteczkę, którą nazwał hCAP-18 (human cationic antimicrobial protein, 18 kDa). Należała ona do rodziny katelicydyn, ewolucyjnie starego systemu obronnego obecnego u ssaków, który dzielimy z psami, krowami, świniami i myszami. U człowieka istnieje tylko jedna katelicydyna, kodowana przez gen CAMP na chromosomie 3p21.3.

W dalszej analizie ustalono, że biologicznie czynna część hCAP-18 znajduje się na końcu C, odcięta od domeny pro przez cięcie proteolityczne. Enzymem odpowiedzialnym za to cięcie jest proteinaza 3 zawarta w ziarnistościach wydzielniczych neutrofili. Powstały fragment liczy 37 aminokwasów, rozpoczyna się dwiema leucynami (stąd „LL”), w ten sposób powstało pojęcie LL-37.

Sørensen i współpracownicy opublikowali kluczową pracę w 1997 r. (Blood). Od tego czasu LL-37 należy do najlepiej zbadanych ludzkich peptydów przeciwbakteryjnych w literaturze, z ponad 6 000 indeksowanymi publikacjami.

Dlaczego społeczność poświęca LL-37 tyle uwagi

Trzy główne powody, dla których LL-37 wyróżnia się spośród peptydów:

1. Antybiotykooporność. Klasyczne antybiotyki działają poprzez hamowanie określonych etapów enzymatycznych (synteza peptydoglikanu, synteza białek, replikacja DNA). Bakterie wykształciły wobec nich oporność poprzez mutacje celu, pompy efflux lub enzymatyczną degradację. LL-37 działa zupełnie inaczej. Atakuje fizyczną integralność błony bakteryjnej. Mechanizm ten jest znacznie trudniejszy do obejścia mutacją, dlatego LL-37 (i pokrewne peptydy) reprezentują jeden z najbardziej obiecujących kierunków rozwoju alternatyw dla antybiotyków przeciwko szczepom opornym, takim jak MRSA, VRE czy wielooporna Pseudomonas.

2. Gojenie ran przewlekłych. W przewlekłych owrzodzeniach żylnych, owrzodzeniach cukrzycowych i oparzeniach poziom endogennego LL-37 w nabłonku jest obniżony (Heilborn 2003). Suplementacja LL-37 bezpośrednio do rany w badaniu klinicznym (Gronberg 2014) wykazała szybsze zamykanie ubytków w trudno gojących się owrzodzeniach. Mechanizm obejmuje stymulację keratynocytów, neoangiogenezę i działanie przeciwbakteryjne jednocześnie, co w gojeniu jest zawsze pożądane.

3. Dwuznaczność immunomodulacyjna. Jest to uczciwy aspekt, którego w tekstach marketingowych często brakuje. LL-37 nie jest „uniwersalnie dobry”. W łuszczycy stwierdzono, że LL-37 wiąże się z własnym DNA uwalnianym z uszkodzonych komórek i tworzy kompleks aktywujący plazmacytoidalne komórki dendrytyczne poprzez TLR9 (Lande 2007). Powstaje prozapalna pętla podtrzymująca przewlekły stan łuszczycowy. LL-37 w skórze łuszczycowej jest zatem mediatorem choroby, nie lekiem. Tę złożoność trzeba znać, jeśli pracuje się z tym peptydem.

Mechanizm działania, co robi na poziomie komórkowym

LL-37 stanowi rzadki przypadek peptydu o wielu równoległych mechanizmach. Nie jest to cząsteczka typu „jeden cel, jeden efekt”. To raczej modułowe narzędzie odporności wrodzonej.

Bezpośrednia aktywność przeciwbakteryjna poprzez rozerwanie błony

LL-37 jest kationowy (ładunek netto +6 w pH fizjologicznym) i amfipatyczny (jedna strona α-helisy hydrofobowa, druga hydrofilowa). Błony bakteryjne zawierają fosfolipidy o ładunku ujemnym w warstwie zewnętrznej (głównie fosfatydyloglicerol u bakterii Gram-dodatnich, lipopolisacharyd u Gram-ujemnych). Błony eukariotyczne zawierają w warstwie zewnętrznej przede wszystkim obojętną fosfatydylocholinę.

Stanowi to zasadę selektywności. LL-37 jest elektrostatycznie przyciągany do błony bakteryjnej, lokalnie układa się w strukturę α-helikalną i jako helisa amfipatyczna wstawia się w dwuwarstwę lipidową. Przy odpowiednim stężeniu tworzy pory transbłonowe (mechanizm typu „barrel-stave” lub „toroidal pore”). Komórka bakteryjna traci homeostazę jonową, ulega lizie osmotycznej i obumiera.

Spektrum aktywności jest bardzo szerokie:

• Bakterie Gram-dodatnie, w tym MRSA, VRE, Streptococcus pyogenes
• Bakterie Gram-ujemne, w tym E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
• Mykobakterie, częściowo również M. tuberculosis in vitro
• Wirusy osłonkowe lipidowe, HSV-1, HSV-2, HIV, RSV, grypa, postulowany efekt także wobec SARS-CoV-2 poprzez naruszenie osłonki
• Grzyby, zwłaszcza Candida albicans

Immunomodulacja, neutralizacja LPS i modulacja cytokin

LL-37 wykonuje jeszcze drugą czynność, która z perspektywy posocznicy i zapalenia przewlekłego może być ważniejsza niż bezpośrednia aktywność przeciwbakteryjna. Wiąże lipopolisacharyd (LPS), endotoksynę bakterii Gram-ujemnych, i neutralizuje jego zdolność do aktywacji TLR4 na makrofagach. Oznacza to, że przy zakażeniu ogólnoustrojowym LL-37 nie tylko zabija bakterie, ale także tłumi odpowiedź prozapalną, która w innym wypadku prowadziłaby do wstrząsu septycznego.

Poprzez receptor FPR2/ALX (formyl peptide receptor 2, wiążący lipoksynę A4) LL-37 aktywuje chemotaksję:

• Neutrofili
• Monocytów
• Limfocytów T
• Komórek tucznych

Jednocześnie moduluje produkcję cytokin. W niektórych kontekstach tłumi IL-6 i TNF-α (działanie przeciwzapalne), w innych kontekstach (łuszczyca, toczeń) odwrotnie je zwiększa. Zależność kontekstowa jest główną cechą LL-37, komplikującą zastosowanie terapeutyczne.

Gojenie ran poprzez transaktywację EGFR

Tokumaru i wsp. (2005) wykazali, że LL-37 aktywuje receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) w keratynocytach, ale w sposób pośredni. Mechanizm jest interesujący. LL-37 inicjuje uwolnienie błonowego HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor) poprzez aktywację metaloproteinaz (głównie ADAM17), a uwolniony HB-EGF aktywuje następnie EGFR autokrynnie lub parakrynnie. Wynik: migracja i proliferacja keratynocytów, reepitelizacja rany.

Heilborn i wsp. (2003) uzupełnili ten obraz obserwacją, że w przewlekłych owrzodzeniach ekspresja LL-37 w nabłonku jest obniżona w porównaniu z ranami ostrymi. Doprowadziło to do hipotezy, że substytucja LL-37 mogłaby przywrócić zdolność do gojenia. Hipoteza ta została potwierdzona w badaniu Phase 1/2 Gronberga.

Stymulacja angiogenezy

LL-37 poprzez receptor FPR2 na komórkach śródbłonkowych stymuluje migrację komórek śródbłonkowych i tworzenie cewek kapilarnych. Efekt angiogenny jest istotny w gojeniu tkanek niedokrwionych (owrzodzenia cukrzycowe, oparzenia), lecz jednocześnie wymaga ostrożności w modelach onkologicznych, gdzie niepożądana angiogeneza sprzyja rozwojowi guza.

Badane zastosowania

W opublikowanej literaturze przedklinicznej i klinicznej udokumentowano efekty LL-37 w następujących obszarach:

• Terapia przeciwbakteryjna szczepów opornych (MRSA, VRE, wielooporna Pseudomonas)
• Gojenie owrzodzeń przewlekłych, dane Phase 1/2 (Gronberg 2014)
• Owrzodzenia cukrzycowe w modelach przedklinicznych
• Oparzenia, wsparcie reepitelizacji
• Modele posocznicy poprzez neutralizację LPS
• Mukowiscydoza i zakażenia płucne (Pseudomonas)
• NChZJ, choroba Leśniowskiego-Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego w modelach zwierzęcych
• Atopowe zapalenie skóry, gdzie endogenny LL-37 jest obniżony
• Łuszczyca jako mediator pętli patologicznej (LL-37 w tym kontekście nie jest terapeutykiem, lecz celem hamowania)
• Trądzik różowaty, gdzie podwyższona ekspresja kalikreiny 5 prowadzi do nadprodukcji LL-37
• Badania onkologiczne, działanie apoptotyczne na komórki nowotworowe (zależne od kontekstu)
• Badania przeciwwirusowe, w tym hipotetyczne działanie ochronne wobec SARS-CoV-2

Nauka i badania

Kluczowe publikacje

Sørensen O.E., et al. (1997). The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 90(7):2796-2803. Oryginalny opis biosyntezy i lokalizacji.

Nizet V., et al. (2001). Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 414(6862):454-457. Dowód in vivo funkcji ochronnej w skórze.

Heilborn J.D., et al. (2003). The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 120(3):379-389. Kluczowa obserwacja dotycząca przewlekłych owrzodzeń.

Tokumaru S., et al. (2005). Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175(7):4662-4668. Mechanizm transaktywacji EGFR.

Lande R., et al. (2007). Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 449(7162):564-569. Dwoista natura LL-37 w łuszczycy.

Carretero M., et al. (2008). In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 128(1):223-236. Kompleksowa walidacja efektu gojącego.

Gronberg A., et al. (2014). Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 22(5):613-621. Badanie kliniczne Phase 1/2.

Szczegółowe rozwinięcia badań

Badanie 1: Sørensen 1997, oryginalna charakterystyka

Cytowanie: Sørensen O.E., Follin P., Johnsen A.H., et al. The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 1997;90(7):2796-2803.

Co zrobiono: Izolacja hCAP-18 z ludzkich neutrofili, sekwencjonowanie, określenie miejsca syntezy i lokalizacji granularnej. Zastosowane metody: chromatografia, spektrometria mas, immunohistochemia szpiku kostnego, immunoelektronowa mikroskopia neutrofili, in vitro cięcie proteinazą 3 oraz charakterystyka fragmentu C-końcowego LL-37.

Co stwierdzono:

• hCAP-18 jest syntetyzowany w mielocytarnym i metamielocytarnym stadium rozwoju neutrofili w szpiku kostnym.
• Lokalizuje się w ziarnistościach specyficznych (ziarnistości wtórnych), nie w ziarnistościach azurofilowych pierwotnych.
• Podczas degranulacji hCAP-18 zostaje uwolniony pozakomórkowo, a proteinaza 3 (z ziarnistości azurofilowych) tnie go proteolitycznie na domenę pro i aktywny fragment C-końcowy LL-37.
• LL-37 wykazuje aktywność przeciwbakteryjną wobec E. coli i Staphylococcus aureus w stężeniach mikromolarnych.
• Pełen hCAP-18 (bez cięcia) jest biologicznie nieaktywny.

Dlaczego to ważne: Praca ta zdefiniowała biologię LL-37 w organizmie ludzkim. Bez odkrycia Sørensena nie wiedzielibyśmy, że LL-37 jest „ukrytym” prekursorem w układzie ziarnistości neutrofili i jest aktywowany przez kontrolowane cięcie enzymatyczne. Cała kolejna nauka, w tym próby terapeutycznego dostarczania syntetycznego LL-37 z pominięciem proteinazy 3, wywodzi się z tej wiedzy.

Badanie 2: Nizet 2001, ochronna funkcja in vivo w skórze

Cytowanie: Nizet V., Ohtake T., Lauth X., et al. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 2001;414(6862):454-457.

Co zrobiono: Wykorzystano myszy knock-out dla katelicydyny (CRAMP, mysiego odpowiednika LL-37), poddano je skórnej inokulacji paciorkowcem z grupy A (Streptococcus pyogenes) i porównano z myszami typu dzikiego. Oceniono rozmiar zmian skórnych, obciążenie bakteryjne, histologię.

Co stwierdzono:

• Myszy knock-out rozwinęły znacznie większe i bardziej inwazyjne zmiany skórne niż kontrole typu dzikiego.
• Obciążenie bakteryjne w tkankach miejscowych było 5 do 10 razy wyższe u myszy knock-out.
• In vitro bakterie izolowane od myszy knock-out wykazywały identyczną wrażliwość na CRAMP jak szczepy referencyjne. Defekt leżał zatem po stronie obrony gospodarza, nie patogenu.
• Suplementacja egzogennego CRAMP do zmian częściowo przywróciła ochronę u myszy knock-out.

Dlaczego to ważne: Był to pierwszy jednoznaczny dowód in vivo, że katelicydyna jest niezbędna do prawidłowej obrony skóry przed zakażeniem bakteryjnym. Podniósł LL-37 (i CRAMP u myszy) z roli „interesującej cząsteczki in vitro” do roli kluczowego komponentu odporności wrodzonej. Model knock-out pozostaje do dziś złotym standardem badania ról AMP w różnych tkankach.

Badanie 3: Heilborn 2003, deficyt LL-37 w owrzodzeniach przewlekłych

Cytowanie: Heilborn J.D., Nilsson M.F., Kratz G., et al. The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 2003;120(3):379-389.

Co zrobiono: Analiza immunohistochemiczna biopsji z ran ostrych (rany chirurgiczne, 3 do 7 dni po cięciu) i ran przewlekłych (owrzodzenia żylne, owrzodzenia cukrzycowe) u pacjentów. Równolegle eksperyment in vitro z zablokowaniem LL-37 w modelu ex vivo ran skórnych i oceną wpływu na reepitelizację.

Co stwierdzono:

• W ranach ostrych LL-37 jest silnie eksprymowany w migrujących keratynocytach na brzegu ubytku, gdzie aktywnie zachodzi reepitelizacja.
• W owrzodzeniach przewlekłych LL-37 w nabłonku jest niemal nieobecny, mimo zwiększonej kolonizacji bakteryjnej (co w warunkach prawidłowych indukowałoby ekspresję).
• Zablokowanie LL-37 in vitro przeciwciałem lub oligonukleotydem antysensownym zatrzymało reepitelizację w modelu ex vivo rany skórnej.
• Suplementacja syntetycznego LL-37 do modelu przywróciła reepitelizację w warunkach zablokowania.

Dlaczego to ważne: Heilborn i zespół powiązali deficyt endogennego LL-37 z patofizjologią ran przewlekłych. Doprowadziło to do hipotezy, że substytucja syntetycznym LL-37 mogłaby stanowić strategię terapeutyczną dla owrzodzeń żylnych, cukrzycowych i innych trudno gojących się ubytków. Właśnie ta hipoteza została dziesięć lat później zwalidowana klinicznie w badaniu Phase 1/2 Gronberga.

Badanie 4: Tokumaru 2005, transaktywacja EGFR w keratynocytach

Cytowanie: Tokumaru S., Sayama K., Shirakata Y., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 2005;175(7):4662-4668.

Co zrobiono: Stymulacja ludzkich keratynocytów LL-37 w hodowli i ocena:

• Migracji w teście scratch wound
• Fosforylacji EGFR i kinaz downstream (ERK1/2, Akt)
• Zastosowania inhibitora EGFR (AG1478) i inhibitorów metaloproteinaz (GM6001, TAPI-1)
• Uwalniania HB-EGF z powierzchni komórki

Co stwierdzono:

• LL-37 w stężeniach 1 do 10 µM silnie stymuluje migrację keratynocytów w teście scratch.
• LL-37 indukuje fosforylację EGFR w ciągu 5 do 15 minut, z aktywacją downstream ERK1/2.
• Inhibitor EGFR AG1478 całkowicie blokuje efekt migracyjny LL-37.
• Inhibitor metaloproteinaz ADAM (TAPI-1) również blokuje migrację, co potwierdza, że EGFR jest aktywowany pośrednio przez shedding HB-EGF.
• LL-37 nie wiąże się bezpośrednio z EGFR, mechanizm jest transaktywacyjny, zależny od metaloproteinazowego uwolnienia liganda.

Dlaczego to ważne: Praca ta odsłoniła konkretny molekularny mechanizm, poprzez który LL-37 wspiera gojenie. Wynika z niej, że LL-37 nie jest jedynie „antybiotykiem”, lecz także modulatorem czynnika wzrostu, który angażuje szlak EGFR, jeden z najważniejszych w regeneracji nabłonka. Zrozumienie tego mechanizmu otworzyło drogę dalszym badaniom kombinacji LL-37 z egzogennymi czynnikami wzrostu.

Badanie 5: Lande 2007, dwoistość w łuszczycy

Cytowanie: Lande R., Gregorio J., Facchinetti V., et al. Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 2007;449(7162):564-569.

Co zrobiono: Badanie skóry łuszczycowej i modelu in vitro z plazmacytoidalnymi komórkami dendrytycznymi (pDC). Pytanie: dlaczego pacjenci łuszczycowi, u których w skórze stężenia LL-37 są podwyższone, paradoksalnie nie mają lepszej ochrony przed zakażeniami, lecz przewlekły stan zapalny? Eksperymenty obejmowały:

• Lokalizację immunofluorescencyjną LL-37 i własnego DNA w zmianach łuszczycowych
• In vitro stymulację pDC kombinacjami LL-37 + DNA z różnych źródeł
• Pomiar produkcji IFN-α przez pDC
• Eksperymenty z hamowaniem TLR9

Co stwierdzono:

• W skórze łuszczycowej LL-37 jest kolokalizowany z własnym DNA uwolnionym z uszkodzonych keratynocytów.
• LL-37 wiąże DNA poprzez interakcje kationowe i przenosi je do endosomów pDC.
• W endosomie DNA aktywuje TLR9, który normalnie nie reaguje na własne DNA (jest ono sekwestrowane w jądrze i nie dociera do TLR9).
• Aktywowany TLR9 wywołuje masywną produkcję interferonu α (IFN-α), który jest siłą napędową zapalenia łuszczycowego.
• Bez LL-37 samo własne DNA nie stymuluje pDC. Kombinacja LL-37 + DNA stanowi jakościowo odmienny sygnał od każdego z nich z osobna.

Dlaczego to ważne: Jest to krytyczna publikacja, którą musi znać każdy użytkownik badawczy LL-37. Pokazuje, że LL-37 nie jest uniwersalnie „dobrym” peptydem. W niektórych kontekstach (łuszczyca, toczeń, niektóre choroby autoimmunologiczne) jest mediatorem patologii, a nie lekiem. Z perspektywy badawczej oznacza to, że kontekstowa specyficzność jest dla LL-37 ważniejsza niż dla innych peptydów. Nie można po prostu „zastosować LL-37” i oczekiwać efektu ochronnego. Zależy on od środowiska tkankowego, obecności DNA, typu komórek immunologicznych.

Badanie 6: Carretero 2008, kompleksowa walidacja efektu gojącego

Cytowanie: Carretero M., Escámez M.J., García M., et al. In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 2008;128(1):223-236.

Co zrobiono: Kompleksowy program eksperymentalny łączący dane in vitro i in vivo:

• Stymulacja ludzkich keratynocytów i fibroblastów LL-37, pomiar proliferacji, migracji, produkcji białek macierzy.
• Mysi model in vivo ran wycinanych skóry, miejscowa aplikacja LL-37 w postaci hydrożelu vs kontrola.
• Ocena kinetyki zamykania rany, jakości blizny, gęstości naczyń włosowatych.
• Analiza mechanistyczna zaangażowania receptora FPR2.

Co stwierdzono:

• LL-37 w stężeniach 1 do 5 µM stymulował proliferację keratynocytów o 30 do 60 % powyżej wartości wyjściowej i fibroblastów o 20 do 40 %.
• LL-37 silnie stymulował angiogenezę w teście tube formation in vitro z komórkami śródbłonkowymi (HUVEC).
• In vivo: u myszy traktowanych LL-37 zamykanie rany następowało o 25 do 35 % szybciej niż w kontroli (dzień 7 i 14).
• Gęstość nowych naczyń włosowatych w gojących się ranach była wyraźnie wyższa w grupie LL-37.
• Antagoniści FPR2 częściowo blokowali efekt angiogenny i migracyjny LL-37, potwierdzając udział tego receptora.

Dlaczego to ważne: Praca Carretero połączyła poziom komórkowy, mechanistyczny i in vivo w spójną walidację efektu gojącego LL-37. Ustanowiła podstawę dowodową dla przejścia klinicznego i posłużyła jako jedna z głównych pozycji referencyjnych w badaniu Phase 1/2 Gronberga kilka lat później.

Badanie 7: Gronberg 2014, Phase 1/2 kliniki w gojeniu owrzodzeń żylnych

Cytowanie: Gronberg A., Mahlapuu M., Stahle M., Whately-Smith C., Rollman O. Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 2014;22(5):613-621.

Co zrobiono: Randomizowane, kontrolowane placebo, podwójnie zaślepione badanie kliniczne Phase 1/2. Włączono pacjentów z przewlekłymi owrzodzeniami żylnymi podudzi, niereagującymi na standardowe leczenie. Randomizacja: miejscowa aplikacja syntetycznego LL-37 w postaci hydrożelu w trzech dawkach (0,5, 1,6, 3,2 mg/ml) vs placebo hydrożelowe, dwa razy w tygodniu przez 4 tygodnie. Obserwacja 8 tygodni. Ocena: bezpieczeństwo, zmniejszenie powierzchni rany, kolonizacja mikrobiologiczna, miejscowe reakcje.

Co stwierdzono:

• Brak poważnych zdarzeń niepożądanych związanych z LL-37 w żadnej grupie.
• Miejscowa tolerancja była dobra, łagodne kłucie przy aplikacji opisywano u <10 % pacjentów.
• Statystycznie istotne przyspieszenie gojenia w grupach 0,5 i 1,6 mg/ml LL-37 wobec placebo.
• Najwyższa dawka 3,2 mg/ml paradoksalnie wykazała mniejszy efekt, co wskazuje na krzywą zależności dawki o kształcie dzwonu (typowe zjawisko dla immunomodulatorów).
• Obciążenie bakteryjne w ranie nie zmieniło się istotnie, efekt gojący nie miał zatem charakteru pierwotnie przeciwbakteryjnego, lecz regeneracyjny.

Dlaczego to ważne: Jest to pierwsze i jak dotąd jedyne opublikowane randomizowane badanie kliniczne LL-37 u ludzi. Zwalidowało koncepcję terapeutycznej suplementacji LL-37 w indykacji owrzodzeń przewlekłych. Pełen proces rejestracyjny nie został jednak kontynuowany. Szwedzka firma Pergamum AB, która sponsorowała badanie, została następnie przejęta przez Promore Pharma, a program kliniczny LL-37 przeszedł kolejne restrukturyzacje. W kontekście badawczym praca Gronberga pozostaje jednak kluczowym punktem odniesienia dla bezpieczeństwa i skuteczności LL-37.

CoA, Certyfikat Analizy

Analiza HPLC partii 2026-04-L

• Czystość: ≥ 98,2 % (HPLC-UV przy 220 nm)
• Tożsamość: potwierdzona spektrometrią mas (MS, ESI+, MW 4 493,33 Da)
• Endotoksyny: < 1,0 EU/mg (test LAL, pomiar zanieczyszczenia toksynami bakteryjnymi)
• Zanieczyszczenie mikrobiologiczne: zgodne z USP <61>
• Pozostałości rozpuszczalników: zgodne z ICH Q3C
• Pozostałości TFA: < 1,5 %
• Zawartość peptydu (AAA, analiza aminokwasów): 75 do 85 % (reszta to sól i woda, typowe dla peptydu tej wielkości)
• Struktura drugorzędowa: potwierdzona spektroskopią CD (random coil w PBS, indukowalna α-helisa w 50 % TFE)
• Profil zanieczyszczeń pokrewnych: sekwencje delecyjne, formy utlenione < 0,5 % każda

[Pobierz CoA (PDF)], [Pobierz KBÚ (PDF)]

Niezależne laboratorium analityczne (weryfikacja zewnętrzna). Oryginalne CoA produkcyjne dostępne na życzenie dla partnerów B2B.

Uwaga dotycząca syntezy: LL-37 z 37 aminokwasami jest niemal pięć razy dłuższy niż typowy krótszy peptyd w naszym katalogu (np. BPC-157 ma 15 aa, AOD-9604 16 aa). Oznacza to znacznie więcej kroków syntetycznych, wyższe ryzyko sekwencji delecyjnych i bardziej wymagającą purifikację. MOLEQUA stosuje wielostopniową purifikację HPLC (pierwsza runda dla czystości, druga dla wymiany soli) oraz weryfikuje strukturę drugorzędową każdej partii spektroskopią CD. Z tego powodu LL-37 należy do naszych produktów klasy premium.

Przechowywanie

Liofilizat (suchy proszek przed rekonstytucją)

• 2 lata w −20 °C (zamrażarka)
• 18 miesięcy w 2 do 8 °C (lodówka)
• Do 14 dni w temperaturze pokojowej (do 25 °C), chronić przed światłem i wilgocią. LL-37 w porównaniu z krótszymi peptydami jest bardziej wrażliwy, długa ekspozycja na temperaturę pokojową nie jest zalecana.

Po rekonstytucji (peptyd w roztworze z wodą bakteriostatyczną)

• Do 30 dni w 2 do 8 °C, chroniony przed światłem
• LL-37 w roztworze jest bardziej wrażliwy niż krótsze peptydy. Należy unikać warunków kwaśnych (pH < 4) i silnie zasadowych (pH > 9), które przyspieszają degradację. Optymalne pH 5 do 7.

Praktyczne zasady przechowywania

• Pozwól fiolce ogrzać się do temperatury pokojowej (15 do 20 min) przed otwarciem. Zimna fiolka i ciepłe powietrze powodują kondensację wilgoci wewnątrz.
• LL-37 jest peptydem amfipatycznym. Przy dłuższym przechowywaniu w roztworze może w nieznacznym stopniu „przyklejać się” do szklanych ścianek fiolki. Jest to zjawisko normalne, ostrożne mieszanie ruchem okrężnym uwalnia peptyd.
• Ciemność jest ważna. LL-37 nie zawiera tryptofanu (najbardziej wrażliwego aminokwasu aromatycznego), lecz zawiera fenyloalaninę i tyrozynę, które również reagują na światło UV. Przechowywać w fiolce z bursztynowego szkła lub w opakowaniu.
• Nie wstrząsać! Stres mechaniczny może zaburzyć strukturę drugorzędową i sprzyjać agregacji (typowy problem peptydów amfipatycznych).
• Roztwór powinien pozostać klarowny. Jakiekolwiek zmętnienie wskazuje na agregację lub zanieczyszczenie, takiej próbki nie należy dalej używać.
• Unikać powtarzanych cykli zamrażania i rozmrażania. W przypadku rekonstytucji większej objętości należy podzielić na alikwoty i zamrozić jednorazowo w −20 °C lub −80 °C.

Rekonstytucja

Wizualizacja 3-krokowa

1. Zrekonstytuuj, dodaj wodę bakteriostatyczną po ściance fiolki.
2. Odmierz, za pomocą kalkulatora (sekcja 8) oblicz wymaganą objętość.
3. Przechowuj, lodówka 2 do 8 °C, chronić przed światłem.

Szczegółowy protokół

Co będzie potrzebne:

• Fiolka LL-37 (5 mg liofilizatu)
• 2 ml wody bakteriostatycznej (zawiera 0,9 % alkoholu benzylowego, konserwant zapobiegający namnażaniu bakterii). Alternatywnie sterylna woda WFI lub 0,9 % NaCl do roztworu bez konserwanta (krótsza trwałość).
• Strzykawka insulinowa 1 ml / 29G
• Gazik alkoholowy

Procedura:

1. Pozwól fiolce LL-37 osiągnąć temperaturę pokojową (15 do 20 min). Zimna fiolka i ciepła woda powodują kondensację, naruszającą stabilność peptydu.
2. Zdezynfekuj gumowe korki obu fiolek (peptyd plus woda BAC) gazikiem alkoholowym. Pozwól alkoholowi odparować.
3. Pobierz wymaganą objętość wody BAC strzykawką insulinową. Standard dla fiolki 5 mg to 2 ml, wynikowe stężenie 2,5 mg/ml.
4. Wstrzyknij wodę powoli po ściance fiolki. Nigdy bezpośrednio na liofilizat. Silny strumień może utworzyć pianę i indukować agregację peptydu.
5. Pozostaw fiolkę w spokoju przez 2 do 3 minut. LL-37 jest dłuższą cząsteczką i rozpuszcza się wolniej niż mniejsze peptydy. Daj jej czas.
6. Delikatnie kołysz fiolką ruchem okrężnym (NIGDY nie potrząsaj!) przez 60 do 90 sekund, aż cały proszek się rozpuści. W przypadku zaobserwowania pozostałych cząstek odczekaj kolejną minutę i powtórz. Roztwór powinien być całkowicie klarowny, bez zmętnień, bez pływających cząstek.
7. Przechowuj w lodówce w 2 do 8 °C, chroniony przed światłem.

Alternatywne objętości dla różnych stężeń wynikowych

Zasada: Dla LL-37 zalecamy objętość 2 ml jako optymalny kompromis. Przy wyższych stężeniach wzrasta ryzyko agregacji, przy niższych spada trwałość roztworu. Pracując z modelami in vitro (hodowle komórkowe), można przygotować stężony stock (5 mg/ml) i rozcieńczać w eksperymencie do stężenia roboczego.

Kombinacje z peptydami, często łączone peptydy

LL-37 jest przede wszystkim peptydem wielofunkcyjnym o działaniu zarówno przeciwbakteryjnym, jak i regeneracyjnym. W protokołach badawczych łączy się go z peptydami uzupełniającymi konkretne mechanizmy.

BPC-157 i TB-500, gojenie ran i regeneracja

Najczęstsza kombinacja w literaturze badawczej dotyczącej gojenia tkanek miękkich. BPC-157 wspiera neowaskularyzację poprzez VEGFR2 i moduluje syntazę NO. TB-500 (fragment tymozyny β4) wspiera migrację komórek i remodelowanie aktyny. LL-37 dostarcza środowisko ochronne przeciwbakteryjne i migrację keratynocytów zależną od EGFR. Wspólnie pokrywają waskularyzację, migrację komórek i obronę przeciwbakteryjną, trzy kluczowe komponenty gojenia ran przewlekłych.

KPV, składnik przeciwzapalny dla wskazań skórnych

KPV (Lys-Pro-Val, tripeptydowy fragment α-MSH) ma silne działanie przeciwzapalne poprzez układ melanokortyny i hamowanie NF-κB. W połączeniu z LL-37 jest badany dla atopowego zapalenia skóry, gdzie LL-37 uzupełnia składnik przeciwbakteryjny, a KPV tłumi przewlekłe zapalenie. W łuszczycy sytuacja jest bardziej złożona, KPV może być korzystny, ale LL-37 może być przeciwskuteczny (Lande 2007).

Tymozyna α1, synergia immunomodulacyjna

Tymozyna α1 jest peptydem o 28 aminokwasach o złożonej aktywności immunomodulacyjnej, w tym wsparciu dojrzewania limfocytów T i aktywacji komórek dendrytycznych poprzez TLR9. Kombinacja z LL-37 jest badana dla zastosowań przeciwzakaźnych (posocznica, ciężkie zakażenia u pacjentów immunologicznie osłabionych, niektóre zakażenia wirusowe). Oba peptydy modulują odporność wrodzoną i nabytą z różnych perspektyw.

GHK-Cu, synergia dermatologiczna

GHK-Cu (tripeptyd związany z miedzią) jest dobrze scharakteryzowany w dermatologii i kosmetologii. Stymuluje syntezę kolagenu, glikozaminoglikanów, wspiera remodelowanie macierzy. W kontekście badawczym łączy się go z LL-37 dla regeneracji skóry po oparzeniach, badań anti-aging i wsparcia gojenia blizn. Mechanizmy są komplementarne, GHK-Cu na poziomie macierzy, LL-37 na poziomie keratynocytów i ochrony przeciwbakteryjnej.

Uzupełniająca uwaga, ostrożność w modelach autoimmunologicznych

W kontekście badawczym chorób autoimmunologicznych (łuszczyca, toczeń, niektóre postacie NChZJ) kombinacja LL-37 z innymi aktywatorami immunologicznymi jest przeciwwskazana. LL-37 w tych modelach może przyczyniać się do patogenezy poprzez pętlę TLR9-IFN-α (Lande 2007). Zawsze najpierw należy zweryfikować zastosowalność LL-37 w konkretnym kontekście modelu.

Kluczowe dane naukowe i cytaty

“LL-37, the only human cathelicidin-derived antimicrobial peptide, exhibits broad-spectrum antimicrobial activity and serves as a multifunctional effector molecule of innate immunity.”
— Dürr UH., Sudheendra US., Ramamoorthy A. (2006), Biochim Biophys Acta 1758(9) — PubMed 16716248

Statystyki z literatury przedklinicznej

• LL-37, ludzki peptyd przeciwbakteryjny katelicydyny, 37 aminokwasów, sekwencja rozpoczynająca się Leu-Leu (stąd nazwa), masa cząsteczkowa 4493,3 Da
• Kodowany przez gen CAMP (chromosom 3p21.3), wyizolowany z białka hCAP-18 poprzez odcięcie proteinazą 3 w neutrofilach
• Zidentyfikowany w grupie Birgitty Agerberth (Karolinska Institutet, Szwecja) w roku 1995
• Standardowe stężenie eksperymentalne: 1–10 μg/ml in vitro do testu przeciwbakteryjnego (E. coli, S. aureus, C. albicans)
• Mechanizm: bezpośrednia permeabilizacja błony bakteryjnej (kationowa amfipatyczna α-helisa), modulacja FPR2/ALX, P2X7, GPCR, indukcja angiogenezy i reepitelizacji
• MIC wobec E. coli: ~5 μM (Travis et al. 2000); wobec S. aureus: ~10–20 μM
• Zidentyfikowano 4 zatwierdzone pochodne terapeutyczne w fazie rozwoju (Pexiganan, Omiganan, Iseganan — wszystkie Phase 2/3 nieudane)
• Ok. 3000+ publikacji w PubMed (1995–2024), kluczowy peptyd odporności wrodzonej

Źródła referencyjne (PubMed)

1. Agerberth B. et al. (1995). “FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis.” Proc Natl Acad Sci USA 92(1):195–199. PubMed 7529412
2. Dürr UH. et al. (2006). “LL-37, the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides.” Biochim Biophys Acta 1758(9):1408–1425. PubMed 16716248
3. Vandamme D. et al. (2012). “A comprehensive summary of LL-37, the factotum human cathelicidin peptide.” Cell Immunol 280(1):22–35. PubMed 23246832

Status rejestracji: LL-37 nie jest zatwierdzonym lekiem do stosowania u ludzi w żadnej strefie regulacyjnej (FDA, EMA, URPL). Pochodne w fazie rozwoju (Pexiganan/MSI-78, Omiganan) przeszły badania kliniczne Phase 2/3 do zastosowań miejscowych (diabetic foot ulcer, rosacea), nie uzyskały zatwierdzenia regulacyjnego. Istniejące dane o samym LL-37 pochodzą z literatury przedklinicznej i in vitro. Produkt jest sprzedawany wyłącznie do badań naukowych w laboratorium (RUO).

Najczęściej zadawane pytania o LL-37

Pytania te odpowiadają na najczęstsze wyszukiwania dotyczące LL-37 w kontekście badań naukowych. Pełna dokumentacja techniczna znajduje się w sekcjach powyżej.

Czym jest LL-37 i do czego stosuje się go w badaniach?

LL-37 (sekwencja LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES, 37 AA, 4493 Da) to jedyny ludzki peptyd antybakteryjny z rodziny katelicydyn pochodzący z prekursora hCAP-18. W badaniach wykazuje bezpośrednią aktywność bakteriobójczą (poprzez permeabilizację błony), immunomodulację i wspieranie gojenia ran. Jest badany w modelach przewlekłych infekcji, mukowiscydozy i chorób dermatologicznych.

Jaką dawkę LL-37 stosują naukowcy w modelach zwierzęcych?

W przedklinicznych modelach zwierzęcych LL-37 testuje się miejscowo w stężeniach 10 do 100 µg/ml lub systemowo 0,5 do 5 mg/kg dootrzewnowo. Formulacje kliniczne (OP-145, preparaty oftalmiczne, Phase 2) testują znacznie niższe dawki w celu minimalizacji cytotoksyczności.

Jaka jest różnica między LL-37 a Thymosin α1?

LL-37 i Thymosin α1 są oba peptydami immunomodulacyjnymi, ale LL-37 celuje w bezpośrednią obronę antybakteryjną (odporność wrodzona, aktywność bakteriobójcza), natomiast Thymosin α1 moduluje odporność adaptacyjną poprzez limfocyty T i sygnalizację TLR. LL-37 ma własną aktywność bakteriobójczą, Thymosin α1 nie.

Czy LL-37 jest zatwierdzonym lekiem czy substancją badawczą?

LL-37 nie jest zatwierdzonym lekiem do stosowania u ludzi. Kilka pochodnych (OP-145, omiganan) przeszło badania Phase 2/3, ale żadna nie uzyskała zatwierdzenia EMA/FDA. Produkt jest sprzedawany wyłącznie do badań naukowych w laboratorium (RUO), a nie do zastosowań klinicznych.

Jak przechowywać i rekonstytuować LL-37?

Liofilizowany LL-37 należy przechowywać w temperaturze −20 °C z ochroną przed światłem, stabilność od 2 do 3 lat; w 2 do 8 °C 6 miesięcy. LL-37 jest amfipatyczny, należy go rekonstytuować w sterylnej wodzie bez detergentów, roztwór stabilny 14 dni w 2 do 8 °C. Unikać powtarzanego zamrażania/rozmrażania.

Jaki jest okres półtrwania LL-37 i jak często podaje się go w badaniach?

LL-37 ma w osoczu krótki okres półtrwania (~30 minut) dzięki szybkiej proteolizie. W tkankach (gdzie jest związany z biofilmem lub błonami komórkowymi) efekt utrzymuje się godziny. Protokoły eksperymentalne stosują 2 do 3× dzienne podanie w badaniach systemowych.

Gdzie kupić LL-37 w UE do badań naukowych?

LL-37 do badań naukowych w UE oferuje Molequa® z dostawą FedEx w ciągu 1 do 3 dni roboczych na terenie Słowacji, Czech i UE. Produkt dostarczany jest w postaci liofilizowanej z certyfikatem analizy (COA), czystość HPLC ≥ 98 %. Produkt jest przeznaczony wyłącznie do badań naukowych w laboratorium (RUO).