LL-37

Visão geral

Origem e porque foi desenvolvido

O LL-37 não é, em sentido estrito, um péptido “de autor”. É um fragmento de uma molécula imunitária humana que transporta em cada neutrófilo, em cada porção de pele e em cada revestimento epitelial. Por isso, a sua caracterização inicial não começou num laboratório de desenho computacional, mas no sangue.

Em 1995, uma equipa dinamarquesa liderada por Ole Sørensen (Rigshospitalet, Copenhaga) isolou dos neutrófilos humanos uma molécula a que chamou hCAP-18 (human cationic antimicrobial protein, 18 kDa). Pertencia à família das catelicidinas, um sistema de defesa evolutivamente antigo, presente nos mamíferos, que partilhamos com cães, vacas, porcos e ratinhos. No ser humano existe apenas uma catelicidina, codificada pelo gene CAMP no cromossoma 3p21.3.

Análises posteriores revelaram que a parte biologicamente ativa da hCAP-18 se encontra no terminal C, separada do pró-domínio por clivagem proteolítica. A enzima concretamente responsável por essa clivagem é a proteinase 3, presente nos grânulos secretores dos neutrófilos. O fragmento resultante tem 37 aminoácidos, começa por duas leucinas (daí o “LL”), e assim nasceu a designação LL-37.

Sørensen e colegas publicaram o artigo-chave em 1997 (Blood). Desde então, o LL-37 está entre os péptidos antimicrobianos humanos mais estudados da literatura, com mais de 6000 publicações indexadas.

Porque é que a comunidade dedica tanta atenção ao LL-37

Há três razões principais para o LL-37 se destacar da multidão de péptidos:

1. Resistência aos antibióticos. Os antibióticos clássicos atuam inibindo passos enzimáticos específicos (síntese do peptidoglicano, síntese proteica, replicação do ADN). As bactérias desenvolveram resistência a eles através de mutações do alvo, de bombas de efluxo ou de degradação enzimática. O LL-37 funciona de forma completamente diferente. Ataca a integridade física da membrana bacteriana. Esse mecanismo é muito mais difícil de contornar por mutação, e é por isso que o LL-37 (e péptidos afins) representa uma das direções mais promissoras no desenvolvimento de alternativas aos antibióticos para estirpes resistentes como o MRSA, os ERV ou a Pseudomonas multirresistente.

2. Cicatrização de feridas crónicas. Nas úlceras venosas crónicas, nas úlceras diabéticas e nas queimaduras, o nível de LL-37 endógeno no epitélio está reduzido (Heilborn 2003). A suplementação de LL-37 diretamente na ferida, num estudo clínico (Gronberg 2014), demonstrou encerramento mais rápido dos defeitos em úlceras de difícil cicatrização. O mecanismo inclui a estimulação simultânea dos queratinócitos, a neoangiogénese e a atividade antimicrobiana, sempre necessária na cicatrização de feridas.

3. Natureza imunomoduladora de dois gumes. Este é o lado honesto, raramente visível nos textos de marketing. O LL-37 não é “universalmente benéfico”. Na psoríase, verificou-se que o LL-37 se liga ao ADN próprio libertado por células danificadas e forma um complexo que ativa as células dendríticas plasmocitoides através do TLR9 (Lande 2007). Cria-se um circuito pró-inflamatório que sustenta o estado psoriático crónico. Na pele psoriática, o LL-37 é, portanto, um mediador da doença e não um medicamento. É preciso compreender esta complexidade ao trabalhar com o péptido.

Mecanismo de ação: o que faz ao nível celular

O LL-37 é um caso raro de péptido com múltiplos mecanismos paralelos. Não é uma molécula de “um alvo, um efeito”. É antes uma ferramenta modular da imunidade inata.

Atividade antimicrobiana direta por rutura da membrana

O LL-37 é catiónico (carga líquida +6 a pH fisiológico) e anfipático (um lado da hélice α é hidrofóbico, o outro hidrofílico). As membranas bacterianas têm fosfolípidos com carga negativa no folheto externo (sobretudo fosfatidilglicerol nas gram-positivas e lipopolissacárido nas gram-negativas). As membranas eucariotas têm predominantemente fosfatidilcolina neutra no folheto externo.

É este o princípio da seletividade. O LL-37 é atraído eletrostaticamente para a membrana bacteriana, dobra-se localmente numa estrutura em hélice α e, enquanto hélice anfipática, insere-se na bicamada lipídica. Em concentração suficiente, forma poros transmembranares (os chamados mecanismos “barrel-stave” ou “toroidal pore”). A célula bacteriana perde a homeostasia iónica, sofre lise osmótica e morre.

O espetro de atividade é muito amplo:

• Bactérias gram-positivas, incluindo MRSA, ERV e Streptococcus pyogenes
• Bactérias gram-negativas, incluindo E. coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella
• Micobactérias, incluindo atividade parcial contra o M. tuberculosis in vitro
• Vírus com invólucro: HSV-1, HSV-2, VIH, VSR e gripe, com um efeito esperado também contra o SARS-CoV-2 por rutura do invólucro
• Fungos, em especial a Candida albicans

Imunomodulação, neutralização do LPS e modulação de citocinas

O LL-37 faz uma segunda coisa que, no contexto da sépsis e da inflamação crónica, pode ser ainda mais importante do que a atividade antimicrobiana direta. Liga-se ao lipopolissacárido (LPS), a endotoxina das bactérias gram-negativas, e neutraliza a sua capacidade de ativar o TLR4 nos macrófagos. Isso significa que, durante uma infeção sistémica, o LL-37 não só mata bactérias como também atenua a resposta pró-inflamatória que de outro modo conduziria ao choque sético.

Através do recetor FPR2/ALX (recetor 2 de péptidos formilados, ligado à lipoxina A4), o LL-37 ativa a quimiotaxia de:

• Neutrófilos
• Monócitos
• Linfócitos T
• Mastócitos

Ao mesmo tempo, modula a produção de citocinas. Nalguns contextos atenua a IL-6 e o TNF-α (anti-inflamatório); noutros (psoríase, lúpus) aumenta-os. A dependência do contexto é a principal característica do LL-37 e a que complica a utilização terapêutica.

Cicatrização de feridas por transativação do EGFR

Tokumaru et al. (2005) mostraram que o LL-37 ativa o recetor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) nos queratinócitos, mas de forma indireta. O mecanismo é interessante. O LL-37 desencadeia a libertação do HB-EGF ligado à membrana (heparin-binding EGF-like growth factor) através da ativação de metaloproteinases (em especial a ADAM17), e o HB-EGF libertado ativa depois o EGFR por via autócrina ou parácrina. Resultado: migração e proliferação dos queratinócitos, reepitelização da ferida.

Heilborn et al. (2003) completaram este quadro com a observação de que a expressão de LL-37 no epitélio está reduzida nas úlceras crónicas em comparação com as feridas agudas. Isso conduziu à hipótese de que a substituição de LL-37 poderia restaurar a capacidade de cicatrização. Foi o que se confirmou no estudo de fase 1/2 de Gronberg.

Estimulação da angiogénese

Através do recetor FPR2 nas células endoteliais, o LL-37 estimula a migração das células endoteliais e a formação de túbulos capilares. Esse efeito angiogénico é importante na cicatrização de tecidos isquémicos (úlceras diabéticas, queimaduras), mas levanta em paralelo cautelas em modelos oncológicos, onde a angiogénese indesejada apoia o crescimento tumoral.

Aplicações investigadas

A literatura pré-clínica e clínica publicada documenta os efeitos do LL-37 nas seguintes áreas:

• Terapêutica antimicrobiana de estirpes resistentes (MRSA, ERV, Pseudomonas multirresistente)
• Cicatrização de úlceras crónicas, dados de fase 1/2 (Gronberg 2014)
• Úlceras diabéticas em modelos pré-clínicos
• Queimaduras, apoio à reepitelização
• Modelos de sépsis através da neutralização do LPS
• Fibrose quística e infeções pulmonares (Pseudomonas)
• DII, doença de Crohn e colite ulcerosa em modelos animais
• Dermatite atópica, em que o LL-37 endógeno está reduzido
• Psoríase como mediador de um circuito patológico (neste contexto o LL-37 não é terapêutica, mas alvo de inibição)
• Rosácea, em que a expressão aumentada da calicreína 5 produz LL-37 em excesso
• Investigação oncológica, efeitos apoptóticos sobre células tumorais (dependentes do contexto)
• Investigação antiviral, incluindo um hipotético efeito protetor contra o SARS-CoV-2

Comprar LL-37: a que deve estar atento

Ao comprar LL-37, o critério decisivo não é o preço, mas a verificabilidade da qualidade. Um péptido de investigação nunca vale mais do que o seu certificado de análise. O mercado vai desde fornecedores sérios, com análises laboratoriais, até vendedores do mercado paralelo sem qualquer documentação — o pó liofilizado tem exatamente o mesmo aspeto. Estes cinco critérios separam-nos.

1. Certificado de análise a fornecer com o próximo lote

A pureza HPLC indica que proporção do pó é realmente LL-37. Os fornecedores sérios documentam ≥ 99 % com um cromatograma. “99 % de pureza” sem cromatograma anexo é uma afirmação, não uma prova.

2. Certificado de análise (CoA) por lote

O documento mais importante. Um CoA por lote corresponde exatamente ao lote que recebe, com número de lote, data e valor de pureza, emitido por um laboratório independente (um laboratório independente como a Analyton Labs). Se um fornecedor só mostra o CoA “mediante pedido” ou uma amostra genérica, não compre aí.

3. Confirmação de identidade por LC-MS

A pureza diz-lhe quanta substância existe; o LC-MS diz-lhe qual é a substância. Através da massa molecular (4493,3 Da) confirma que se trata da identidade correta do LL-37 e não de um péptido mais barato com a etiqueta trocada.

4. Origem e envio a partir da UE com rastreabilidade

Um fornecedor com armazém na UE e rastreabilidade completa do lote leva vantagem sobre as importações paralelas da Ásia: transporte mais curto e refrigerado, sem risco aduaneiro. A Molequa® envia de dentro da UE, normalmente em 3 a 5 dias úteis, sem atrasos aduaneiros pós-Brexit.

5. Forma de entrega correta: liofilizado

Um LL-37 de qualidade é entregue como liofilizado (pó branco), não como solução pré-misturada. Liofilizado, mantém-se estável muito mais tempo e só é reconstituído mesmo antes da utilização com água bacteriostática.

Verifique a qualidade em 30 segundos

• ✅ CoA por lote disponível publicamente (não apenas “mediante pedido”)?
• ✅ Pureza demonstrada com cromatograma?
• ✅ Identidade confirmada por LC-MS (massa 4493,3 Da)?
• ✅ Armazém na UE e rastreabilidade do lote?
• ✅ Entregue como liofilizado com instruções de conservação claras?

Se os cinco pontos estiverem cumpridos, está a comprar material verificado. Cada lote da Molequa® é enviado com um certificado de análise por lote e confirmação por LC-MS; encontra o CoA atual na secção Resultados das análises do lote, mais abaixo.

Aviso legal: o LL-37 é um péptido de investigação e não é um medicamento aprovado. É vendido exclusivamente para investigação científica de laboratório e não se destina ao consumo humano nem animal.

Ciência e estudos

Publicações-chave

Sørensen O.E., et al. (1997). The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 90(7):2796 a 2803. Descrição original da biossíntese e da localização.

Nizet V., et al. (2001). Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 414(6862):454 a 457. Prova in vivo da função protetora na pele.

Heilborn J.D., et al. (2003). The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 120(3):379 a 389. Observação-chave sobre as úlceras crónicas.

Tokumaru S., et al. (2005). Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175(7):4662 a 4668. Mecanismo de transativação do EGFR.

Lande R., et al. (2007). Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 449(7162):564 a 569. A natureza de dois gumes do LL-37 na psoríase.

Carretero M., et al. (2008). In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 128(1):223 a 236. Validação exaustiva do efeito na cicatrização.

Gronberg A., et al. (2014). Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 22(5):613 a 621. Ensaio clínico de fase 1/2.

Estudos detalhados

Estudo 1: Sørensen 1997, a caracterização original

Citação: Sørensen O.E., Follin P., Johnsen A.H., et al. The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 1997;90(7):2796 a 2803.

O que fizeram: Isolamento da hCAP-18 a partir de neutrófilos humanos, sequenciação, identificação do local de síntese e da localização granular. Métodos utilizados: cromatografia, espetrometria de massa, imuno-histoquímica da medula óssea, microscopia imunoeletrónica de neutrófilos, clivagem in vitro pela proteinase 3 e caracterização do fragmento C-terminal LL-37.

O que encontraram:

• A hCAP-18 é sintetizada durante o estádio de mielócito e metamielócito do desenvolvimento dos neutrófilos na medula óssea.
• Localiza-se nos grânulos específicos (grânulos secundários) e não nos grânulos azurófilos primários.
• Na desgranulação, a hCAP-18 é libertada para o meio extracelular e a proteinase 3 (dos grânulos azurófilos) cliva-a proteoliticamente no pró-domínio e no fragmento C-terminal ativo LL-37.
• O LL-37 apresenta atividade antimicrobiana contra E. coli e Staphylococcus aureus em concentrações micromolares.
• A hCAP-18 completa (sem clivagem) é biologicamente inativa.

Porque interessa: Este estudo definiu a biologia do LL-37 no corpo humano. Sem a descoberta de Sørensen, não saberíamos que o LL-37 é um precursor “escondido” no sistema granular dos neutrófilos, ativado por clivagem enzimática controlada. Toda a investigação subsequente, incluindo as tentativas terapêuticas de administrar LL-37 sintético diretamente, sem depender da proteinase 3, assenta nesta descoberta.

Estudo 2: Nizet 2001, função protetora in vivo na pele

Citação: Nizet V., Ohtake T., Lauth X., et al. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 2001;414(6862):454 a 457.

O que fizeram: Utilizaram ratinhos knock-out para a catelicidina (CRAMP, o equivalente murino do LL-37), expuseram-nos a inoculação cutânea com estreptococo do grupo A (Streptococcus pyogenes) e compararam-nos com ratinhos selvagens. Avaliaram o tamanho da lesão, a carga bacteriana e a histologia.

O que encontraram:

• Os ratinhos knock-out desenvolveram lesões cutâneas marcadamente maiores e mais invasivas do que os controlos selvagens.
• A carga bacteriana nos tecidos locais era 5 a 10 vezes superior nos ratinhos knock-out.
• In vitro, as bactérias isoladas dos ratinhos knock-out tinham a mesma sensibilidade ao CRAMP que as estirpes de referência. O defeito estava, portanto, na defesa do hospedeiro e não no agente patogénico.
• A suplementação de CRAMP exógeno nas lesões restaurou parcialmente a proteção nos ratinhos knock-out.

Porque interessa: Foi a primeira prova clara in vivo de que a catelicidina é necessária para a defesa normal da pele contra a infeção bacteriana. Elevou o LL-37 (e o CRAMP no ratinho) do papel de “molécula interessante in vitro” ao de componente-chave da imunidade inata. O modelo knock-out continua a ser o padrão de ouro no estudo do papel dos PAM em vários tecidos.

Estudo 3: Heilborn 2003, o défice de LL-37 nas úlceras crónicas

Citação: Heilborn J.D., Nilsson M.F., Kratz G., et al. The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 2003;120(3):379 a 389.

O que fizeram: Análise imuno-histoquímica de biópsias de feridas agudas (feridas cirúrgicas, 3 a 7 dias após a incisão) e de feridas crónicas (úlceras venosas, úlceras diabéticas) em doentes humanos. Em paralelo, uma experiência in vitro em que bloquearam o LL-37 num modelo ex vivo de ferida cutânea e avaliaram o efeito sobre a reepitelização.

O que encontraram:

• Nas feridas agudas, o LL-37 é fortemente expresso nos queratinócitos migratórios da margem da ferida, onde a reepitelização decorre ativamente.
• Nas úlceras crónicas, o LL-37 está quase ausente do epitélio, apesar da colonização bacteriana aumentada (que normalmente induziria a sua expressão).
• O bloqueio in vitro do LL-37 com anticorpo ou com oligonucleótido antisense interrompeu a reepitelização no modelo ex vivo de ferida cutânea.
• A suplementação de LL-37 sintético no modelo restaurou a reepitelização nas condições de bloqueio.

Porque interessa: Heilborn e colegas ligaram o défice de LL-37 endógeno à fisiopatologia das feridas crónicas. Isso conduziu à hipótese de que a substituição por LL-37 sintético poderia ser uma estratégia terapêutica para úlceras venosas, úlceras diabéticas e outros defeitos de difícil cicatrização. Essa hipótese foi validada clinicamente dez anos mais tarde no estudo de fase 1/2 de Gronberg.

Estudo 4: Tokumaru 2005, transativação do EGFR nos queratinócitos

Citação: Tokumaru S., Sayama K., Shirakata Y., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 2005;175(7):4662 a 4668.

O que fizeram: Estimulação de queratinócitos humanos com LL-37 em cultura e avaliação de:

• Migração num scratch wound assay
• Fosforilação do EGFR e das cinases a jusante (ERK1/2, Akt)
• Utilização de um inibidor do EGFR (AG1478) e de inibidores de metaloproteinases (GM6001, TAPI-1)
• Libertação de HB-EGF da superfície celular

O que encontraram:

• O LL-37, em concentrações de 1 a 10 µM, estimula fortemente a migração dos queratinócitos no scratch assay.
• O LL-37 induz a fosforilação do EGFR em 5 a 15 minutos, com ativação a jusante das ERK1/2.
• O inibidor do EGFR AG1478 bloqueia por completo o efeito migratório do LL-37.
• O inibidor das metaloproteinases ADAM (TAPI-1) bloqueia igualmente a migração, o que confirma que o EGFR é ativado indiretamente, pelo shedding do HB-EGF.
• O LL-37 não se liga diretamente ao EGFR; o mecanismo é a transativação através da libertação do ligando dependente de metaloproteinases.

Porque interessa: Este estudo revelou o mecanismo molecular concreto pelo qual o LL-37 apoia a cicatrização. Daqui decorre que o LL-37 não é apenas um “antibiótico”, mas também um modulador de fatores de crescimento que envolve a via do EGFR, uma das mais importantes na regeneração epitelial. A compreensão deste mecanismo abriu a porta a novos estudos que combinam o LL-37 com fatores de crescimento exógenos.

Estudo 5: Lande 2007, a natureza de dois gumes na psoríase

Citação: Lande R., Gregorio J., Facchinetti V., et al. Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 2007;449(7162):564 a 569.

O que fizeram: Estudo da pele psoriática e um modelo in vitro com células dendríticas plasmocitoides (pDC). A pergunta: porque é que os doentes com psoríase, que têm níveis elevados de LL-37 na pele, não têm paradoxalmente melhor proteção contra a infeção, mas sim inflamação crónica? As experiências incluíram:

• Localização por imunofluorescência do LL-37 e do ADN próprio nas lesões psoriáticas
• Estimulação in vitro de pDC com combinações de LL-37 + ADN de várias origens
• Medição da produção de IFN-α pelas pDC
• Experiências de inibição do TLR9

O que encontraram:

• Na pele psoriática, o LL-37 está colocalizado com o ADN próprio libertado pelos queratinócitos danificados.
• O LL-37 liga-se ao ADN por interações catiónicas e transporta-o para os endossomas das pDC.
• No endossoma, o ADN ativa o TLR9, que normalmente não responde ao ADN próprio (porque esse ADN está sequestrado no núcleo e não chega ao TLR9).
• O TLR9 ativado desencadeia uma produção maciça de interferão α (IFN-α), a força motriz da inflamação psoriática.
• Sem LL-37, o ADN próprio isolado não estimula as pDC. A combinação de LL-37 + ADN é um sinal qualitativamente diferente de cada um deles em separado.

Porque interessa: Esta é uma publicação crítica que qualquer utilizador do LL-37 em investigação tem de conhecer. Mostra que o LL-37 não é um péptido universalmente “bom”. Nalguns contextos (psoríase, lúpus, determinadas doenças autoimunes) é um mediador da patologia e não um tratamento. Do ponto de vista da investigação, isso significa que a especificidade do contexto é mais importante no LL-37 do que noutros péptidos. Não se pode simplesmente “aplicar LL-37” e esperar um efeito protetor. Depende do ambiente tecidual, da presença de ADN e do tipo de células imunitárias.

Estudo 6: Carretero 2008, validação exaustiva do efeito na cicatrização

Citação: Carretero M., Escámez M.J., García M., et al. In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 2008;128(1):223 a 236.

O que fizeram: Um programa experimental abrangente que ligou dados in vitro e in vivo:

• Estimulação de queratinócitos e fibroblastos humanos com LL-37, medindo a proliferação, a migração e a produção de proteínas da matriz.
• Modelo murino in vivo de feridas cutâneas excisionais, com aplicação local de LL-37 numa formulação em hidrogel vs. controlo.
• Avaliação da cinética de encerramento da ferida, da qualidade do tecido cicatricial e da densidade capilar.
• Análise mecanística do envolvimento do recetor FPR2.

O que encontraram:

• O LL-37, em concentrações de 1 a 5 µM, estimulou a proliferação dos queratinócitos em 30 a 60 % acima do valor basal e a dos fibroblastos em 20 a 40 %.
• O LL-37 estimulou fortemente a angiogénese num ensaio in vitro de formação de túbulos com células endoteliais (HUVEC).
• In vivo: os ratinhos tratados com LL-37 tiveram um encerramento da ferida mais rápido, em 25 a 35 %, face ao controlo (dias 7 e 14).
• A densidade capilar nas feridas em cicatrização foi significativamente maior no grupo LL-37.
• Os antagonistas do FPR2 bloquearam parcialmente o efeito angiogénico e migratório do LL-37, confirmando o envolvimento deste recetor.

Porque interessa: O estudo de Carretero combinou os níveis celular, mecanístico e in vivo numa validação coerente do efeito do LL-37 na cicatrização. Estabeleceu a base de evidência para a translação clínica e serviu de referência principal no estudo de fase 1/2 de Gronberg, alguns anos mais tarde.

Estudo 7: Gronberg 2014, ensaio clínico de fase 1/2 na cicatrização de úlceras venosas

Citação: Gronberg A., Mahlapuu M., Stahle M., Whately-Smith C., Rollman O. Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 2014;22(5):613 a 621.

O que fizeram: Ensaio clínico de fase 1/2, aleatorizado, controlado por placebo e em dupla ocultação. Incluíram doentes com úlceras venosas crónicas da perna que não tinham respondido ao tratamento padrão. Aleatorização: aplicação local de LL-37 sintético numa formulação em hidrogel, em três doses (0,5, 1,6 e 3,2 mg/ml), vs. hidrogel placebo, duas vezes por semana durante 4 semanas. Seguimento de 8 semanas. Avaliação: segurança, redução do tamanho da ferida, colonização microbiana e reações locais.

O que encontraram:

• Nenhum acontecimento adverso grave relacionado com o LL-37 em qualquer dos grupos.
• A tolerabilidade local foi boa; um ligeiro ardor na aplicação foi relatado por menos de 10 % dos doentes.
• Aceleração estatisticamente significativa da cicatrização nos grupos de LL-37 de 0,5 e 1,6 mg/ml face ao placebo.
• A dose mais alta, de 3,2 mg/ml, mostrou paradoxalmente um efeito menor, o que aponta para uma curva dose-resposta em forma de sino (fenómeno típico dos imunomoduladores).
• A carga bacteriana na ferida não se alterou de forma significativa; o efeito na cicatrização não foi, portanto, primariamente antimicrobiano, mas regenerativo.

Porque interessa: Este é o primeiro, e até agora único, estudo clínico aleatorizado publicado sobre o LL-37 em seres humanos. Validou o conceito de suplementação terapêutica de LL-37 na indicação das úlceras crónicas. O processo de registo completo não avançou, porém. A empresa sueca Pergamum AB, que patrocinou o estudo, foi mais tarde adquirida pela Promore Pharma, e o programa clínico do LL-37 passou por nova reestruturação. No contexto de investigação, o estudo de Gronberg mantém-se, ainda assim, como ponto de referência-chave de segurança e eficácia para o LL-37.

CoA: certificado de análise

Especificação de qualidade (CoA com o primeiro lote)

Os valores abaixo são a especificação de libertação face à qual o primeiro lote é testado. O CoA assinado será acrescentado assim que for emitido.

• Pureza: ≥ 98,2 % (HPLC-UV a 220 nm)
• Identidade: confirmada por espetrometria de massa (MS, ESI+, MM 4493,33 Da)
• Endotoxinas: < 1,0 EU/mg (teste LAL, medição da contaminação por toxina bacteriana)
• Contaminação microbiana: cumpre a USP <61>
• Solventes residuais: cumpre a ICH Q3C
• Resíduos de TFA: < 1,5 %
• Teor peptídico (AAA, análise de aminoácidos): 75 a 85 % (o restante é sal e água, típico de um péptido desta dimensão)
• Estrutura secundária: confirmada por espetroscopia de DC (random coil em PBS, hélice α indutível em TFE a 50 %)
• Perfil de impurezas relacionadas: sequências de deleção e formas oxidadas < 0,5 % cada

[Descarregar CoA (PDF)], [Descarregar FDS (PDF)]

Laboratório analítico independente (verificação por terceiros). CoA original de fabrico disponível mediante pedido para parceiros B2B.

Nota sobre a síntese: o LL-37, com 37 aminoácidos, é quase cinco vezes mais longo do que um péptido curto típico do nosso catálogo (por exemplo, o BPC-157 tem 15 aa e o AOD-9604 16 aa). Isso significa muito mais passos sintéticos, maior risco de sequências de deleção e uma purificação mais exigente. A MOLEQUA aplica uma purificação HPLC por etapas (primeira ronda para a pureza, segunda ronda para a troca de sal) e verifica a estrutura secundária de cada lote por espetroscopia de DC. É por isso que o LL-37 está entre os nossos produtos de gama premium.

Conservação

Liofilizado (pó seco antes da reconstituição)

• 2 anos a −20 °C (congelador)
• 18 meses a 2 a 8 °C (frigorífico)
• Até 14 dias à temperatura ambiente (até 25 °C), protegido da luz e da humidade. O LL-37 é mais sensível do que os péptidos curtos, pelo que não se recomenda a exposição prolongada à temperatura ambiente.

Após a reconstituição (péptido em solução com água bacteriostática)

• Até 30 dias a 2 a 8 °C, protegido da luz
• O LL-37 em solução é mais sensível do que os péptidos curtos. Evite condições ácidas (pH < 4) e fortemente alcalinas (pH > 9), que aceleram a degradação. pH ótimo de 5 a 7.

Regras práticas de conservação

• Deixe o frasco atingir a temperatura ambiente (15 a 20 min) antes de o abrir. Frasco frio e ar quente originam condensação de humidade no interior.
• O LL-37 é um péptido anfipático. Pode, em pequena medida, “aderir” às paredes de vidro do frasco durante uma conservação prolongada em solução. É um fenómeno normal; um movimento circular suave liberta o péptido.
• A escuridão é importante. O LL-37 não contém triptofano (o aminoácido aromático mais sensível), mas contém fenilalanina e tirosina, que também reagem à luz UV. Guarde num frasco âmbar ou na caixa.
• Não agite! O stress mecânico pode perturbar a estrutura secundária e favorecer a agregação (problema típico dos péptidos anfipáticos).
• A solução deve manter-se límpida. Qualquer turvação indica agregação ou contaminação; não continue a utilizar essa amostra.
• Evite ciclos repetidos de congelação e descongelação. Se reconstituir um volume maior, divida em alíquotas e congele uma única vez a −20 °C ou a −80 °C.

Combinações com péptidos: péptidos frequentemente associados

O LL-37 é, antes de mais, um péptido multifuncional com efeitos antimicrobianos e regenerativos. Nos protocolos de investigação é combinado com péptidos que complementam mecanismos específicos.

BPC-157 e TB-500: cicatrização de feridas e regeneração

A combinação mais frequente na literatura de investigação sobre a cicatrização de tecidos moles. O BPC-157 apoia a neovascularização pelo VEGFR2 e modula a NO sintase. O TB-500 (fragmento da timosina β4) apoia a migração celular e a remodelação da actina. O LL-37 contribui com um ambiente protetor antimicrobiano e com a migração de queratinócitos mediada pelo EGFR. Em conjunto cobrem a vascularização, a migração celular e a defesa antimicrobiana, três componentes-chave da cicatrização das feridas crónicas.

KPV: componente anti-inflamatória para indicações cutâneas

O KPV (Lys-Pro-Val, um fragmento tripeptídico da α-MSH) tem fortes efeitos anti-inflamatórios pelo sistema melanocortina e pela inibição do NF-κB. Em combinação com o LL-37 está a ser investigado na dermatite atópica, em que o LL-37 fornece a componente antimicrobiana e o KPV atenua a inflamação crónica. Na psoríase a situação é mais complexa; o KPV pode ser benéfico, mas o LL-37 pode ser contraproducente (Lande 2007).

Timosina α1: sinergia imunomoduladora

A timosina α1 é um péptido de 28 aminoácidos com atividade imunomoduladora complexa, incluindo o apoio à maturação das células T e a ativação das células dendríticas pelo TLR9. A combinação com o LL-37 está a ser explorada em aplicações anti-infeciosas (sépsis, infeções graves em doentes imunocomprometidos, determinadas infeções virais). Ambos os péptidos modulam a imunidade inata e adaptativa a partir de ângulos diferentes.

GHK-Cu: sinergia dermatológica

O GHK-Cu (um tripéptido com cobre ligado) está bem caracterizado em dermatologia e cosmetologia. Estimula a síntese de colagénio e de glicosaminoglicanos e apoia a remodelação da matriz. Em contextos de investigação, é combinado com o LL-37 para a regeneração cutânea após queimadura, a investigação antienvelhecimento e o apoio à cicatrização de cicatrizes. Os mecanismos são complementares: o GHK-Cu ao nível da matriz e o LL-37 ao nível do queratinócito e da proteção antimicrobiana.

Nota adicional: cautela nos modelos autoimunes

Em contextos de investigação de doenças autoimunes (psoríase, lúpus, determinadas formas de DII), a combinação do LL-37 com outros ativadores imunitários está contraindicada. Nesses modelos, o LL-37 pode contribuir para a patogénese através do circuito TLR9-IFN-α (Lande 2007). Verifique sempre primeiro a aplicabilidade do LL-37 no contexto específico do modelo.

Números científicos-chave e citações

“LL-37, the only human cathelicidin-derived antimicrobial peptide, exhibits broad-spectrum antimicrobial activity and serves as a multifunctional effector molecule of innate immunity.”
Dürr UH., Sudheendra US., Ramamoorthy A. (2006), Biochim Biophys Acta 1758(9), PubMed 16716248

Estatísticas da literatura pré-clínica

• LL-37, o péptido antimicrobiano catelicidina humano, 37 aminoácidos, sequência que começa por Leu-Leu (daí o nome), peso molecular 4493,3 Da
• Codificado pelo gene CAMP (cromossoma 3p21.3), libertado da proteína hCAP-18 por clivagem da proteinase 3 nos neutrófilos
• Identificado pelo grupo de Birgitta Agerberth (Karolinska Institutet, Suécia) em 1995
• Concentração experimental padrão: 1 a 10 μg/ml in vitro em ensaios antimicrobianos (E. coli, S. aureus, C. albicans)
• Mecanismo: permeabilização direta da membrana bacteriana (hélice α catiónica anfipática), modulação de FPR2/ALX, P2X7 e GPCR, indução da angiogénese e da reepitelização
• CMI contra E. coli: ~5 μM (Travis et al. 2000); contra S. aureus: ~10 a 20 μM
• 4 derivados terapêuticos identificados em desenvolvimento (pexiganan, omiganan, iseganan; todos falharam na fase 2/3)
• Aproximadamente 3000 e mais publicações na PubMed (1995–2024), um péptido de referência da imunidade inata

Fontes de referência (PubMed)

1. Agerberth B. et al. (1995). “FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis.” Proc Natl Acad Sci USA 92(1):195–199. PubMed 7529412
2. Dürr UH. et al. (2006). “LL-37, the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides.” Biochim Biophys Acta 1758(9):1408–1425. PubMed 16716248
3. Vandamme D. et al. (2012). “A comprehensive summary of LL-37, the factotum human cathelicidin peptide.” Cell Immunol 280(1):22–35. PubMed 23246832

Estatuto regulamentar: o LL-37 não é um medicamento de uso humano aprovado em nenhuma zona regulamentar (FDA, EMA, INFARMED). Os derivados em desenvolvimento (pexiganan/MSI-78, omiganan) avançaram para ensaios clínicos de fase 2/3 em aplicações tópicas (úlcera do pé diabético, rosácea), mas não obtiveram aprovação regulamentar. Os dados existentes sobre o próprio LL-37 provêm da literatura pré-clínica e in vitro. O produto é vendido estritamente para investigação científica de laboratório (RUO).

Perguntas frequentes sobre LL-37

Estas perguntas respondem às pesquisas mais frequentes sobre o LL-37 em contexto de investigação. Para a documentação técnica completa, consulte as secções acima.

O que é o LL-37 e para que é utilizado em investigação?

O LL-37 (sequência LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES, 37 AA, 4493 Da) é o único péptido antimicrobiano catelicidina humano, derivado do precursor hCAP-18. Em investigação, apresenta atividade bactericida direta (por permeabilização da membrana), imunomodulação e apoio à cicatrização de feridas. É estudado em modelos de infeções crónicas, de fibrose quística e de doenças dermatológicas.

Que dose de LL-37 usam os cientistas em modelos animais?

Em modelos animais pré-clínicos, o LL-37 é testado por via tópica em concentrações de 10 a 100 µg/ml ou por via sistémica em 0,5 a 5 mg/kg por via intraperitoneal. As formulações clínicas (OP-145, preparações oftálmicas, fase 2) testam doses substancialmente mais baixas para minimizar a citotoxicidade.

Qual é a diferença entre o LL-37 e a timosina α1?

O LL-37 e a timosina α1 são ambos péptidos imunomoduladores, mas o LL-37 dirige-se à defesa antimicrobiana direta (imunidade inata, atividade bactericida), enquanto a timosina α1 modula a imunidade adaptativa através das células T e da sinalização TLR. O LL-37 tem atividade bactericida intrínseca; a timosina α1 não.

O LL-37 é um medicamento aprovado ou uma substância de investigação?

O LL-37 não é um medicamento de uso humano aprovado. Vários derivados (OP-145, omiganan) passaram por ensaios de fase 2/3, mas nenhum obteve aprovação da EMA ou da FDA. O produto é vendido estritamente para investigação científica de laboratório (RUO), não para uso clínico.

Como se conserva o LL-37?

O LL-37 liofilizado deve ser conservado a −20 °C, protegido da luz, com uma estabilidade de 2 a 3 anos; a 2 a 8 °C, 6 meses. O LL-37 é anfipático: reconstitua em água estéril sem detergentes; a solução é estável 14 dias a 2 a 8 °C. Evite ciclos repetidos de congelação e descongelação.

Qual é a semivida do LL-37 e com que frequência é administrado nos estudos?

O LL-37 tem uma semivida plasmática curta (cerca de 30 minutos), devido à proteólise rápida. Nos tecidos (onde está ligado ao biofilme ou às membranas celulares), o efeito persiste durante horas. Os protocolos experimentais usam 2 a 3 administrações diárias nos estudos sistémicos.

Onde comprar LL-37 na UE para investigação científica?

O LL-37 para investigação científica na UE é disponibilizado pela Molequa®, com entrega FedEx em 3 a 5 dias úteis na UE. O produto é enviado liofilizado, com certificado de análise (COA) e pureza HPLC ≥ 98 %. O produto destina-se estritamente a investigação científica de laboratório (RUO).