LL-37

Общ преглед

Откъде идва и защо е разработен

LL-37 не е „дизайнерски” пептид в строгия смисъл на думата. Той е фрагмент от човешка имунна молекула, който носите във всеки неутрофил, във всяко късче кожа и във всяка епителна покривка. Затова първоначалното му характеризиране започва не в лаборатория за компютърен дизайн, а в кръвта.

През 1995 г. датски екип, ръководен от Ole Sørensen (Rigshospitalet, Копенхаген), изолира от човешки неутрофили молекула, която назовава hCAP-18 (човешки катионен антимикробен белтък, 18 kDa). Тя принадлежи към семейството на кателицидините, еволюционно древна защитна система при бозайниците, която споделяме с кучета, крави, свине и мишки. При човека съществува само един кателицидин, кодиран от гена CAMP върху хромозома 3p21.3.

По-нататъшният анализ показва, че биологично активната част на hCAP-18 се намира в C-края, отделена от про-домена чрез протеолитично разцепване. Конкретният ензим, отговорен за това разцепване, е протеиназа 3 в секреторните гранули на неутрофилите. Полученият фрагмент има 37 аминокиселини, започва с два левцина (оттам „LL”) и така се ражда терминът LL-37.

Sørensen и колеги публикуват ключовата статия през 1997 г. (Blood). Оттогава LL-37 е сред най-изучаваните човешки антимикробни пептиди в литературата, с повече от 6000 индексирани публикации.

Защо общността обръща толкова внимание на LL-37

Има три основни причини LL-37 да се откроява сред останалите пептиди:

1. Антибиотична резистентност. Класическите антибиотици действат чрез потискане на конкретни ензимни стъпки (синтез на пептидогликан, синтез на белтъци, репликация на ДНК). Бактериите са развили резистентност към тях чрез мутации в мишената, ефлуксни помпи или ензимно разграждане. LL-37 действа съвсем различно. Той атакува физическата цялост на бактериалната мембрана. Този механизъм е много по-труден за заобикаляне чрез мутация и именно затова LL-37 (и сродните пептиди) представляват едно от най-обещаващите направления в разработването на алтернативи на антибиотиците срещу резистентни щамове като MRSA, VRE или мултирезистентна Pseudomonas.

2. Заздравяване на хронични рани. При хронични венозни язви, диабетни язви и изгаряния нивото на ендогенния LL-37 в епитела е понижено (Heilborn 2003). Прилагането на LL-37 директно в раната в клинично проучване (Gronberg 2014) демонстрира по-бързо затваряне на дефектите при трудно заздравяващи язви. Механизмът включва едновременно стимулиране на кератиноцитите, неоангиогенеза и антимикробна активност, което винаги е необходимо при заздравяването на рани.

3. Двойствена имуномодулаторна природа. Това е честната страна, която рядко се вижда в маркетинговите текстове. LL-37 не е „универсално полезен”. При псориазис е установено, че LL-37 се свързва със собствена ДНК от увредени клетки и образува комплекс, който активира плазмоцитоидните дендритни клетки чрез TLR9 (Lande 2007). Създава се провъзпалителен кръг, който поддържа хроничното псориатично състояние. Затова в псориатичната кожа LL-37 е медиатор на заболяването, а не лекарство. Тази сложност трябва да се разбира при работа с пептида.

Механизъм на действие: какво прави на клетъчно ниво

LL-37 е рядък случай на пептид с множество паралелни механизми. Той не е молекула от типа „една мишена, един ефект”. По-скоро е модулен инструмент на вродения имунитет.

Пряка антимикробна активност чрез разрушаване на мембраната

LL-37 е катионен (нетен заряд +6 при физиологично pH) и амфипатичен (едната страна на α-спиралата е хидрофобна, другата хидрофилна). Бактериалните мембрани имат отрицателно заредени фосфолипиди във външния слой (особено фосфатидилглицерол при грам-положителните, липополизахарид при грам-отрицателните). Еукариотните мембрани имат предимно неутрален фосфатидилхолин във външния слой.

Това е принципът на селективността. LL-37 се привлича електростатично към бактериалната мембрана, локално се нагъва в α-спирална структура и като амфипатична спирала се вгражда в липидния двоен слой. При достатъчна концентрация образува трансмембранни пори (така нареченият механизъм „barrel-stave” или „toroidal pore”). Бактериалната клетка губи йонната си хомеостаза, лизира осмотично и загива.

Спектърът на активност е много широк:

• Грам-положителни бактерии, включително MRSA, VRE, Streptococcus pyogenes
• Грам-отрицателни бактерии, включително E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
• Микобактерии, включително частична активност срещу M. tuberculosis in vitro
• Обвити вируси: HSV-1, HSV-2, HIV, RSV, инфлуенца, с очакван ефект и срещу SARS-CoV-2 чрез разрушаване на обвивката
• Гъбички, особено Candida albicans

Имуномодулация, неутрализиране на LPS и модулация на цитокините

LL-37 прави и второ нещо, което в контекста на сепсиса и хроничното възпаление може да е дори по-важно от прякото антимикробно действие. Той свързва липополизахарида (LPS), ендотоксина на грам-отрицателните бактерии, и неутрализира способността му да активира TLR4 върху макрофагите. Това означава, че при системна инфекция LL-37 не само убива бактерии, но и потушава провъзпалителния отговор, който иначе би довел до септичен шок.

Чрез рецептора FPR2/ALX (формил-пептиден рецептор 2, свързан с липоксин A4) LL-37 активира хемотаксиса на:

• Неутрофили
• Моноцити
• T-лимфоцити
• Мастоцити

Едновременно с това той модулира производството на цитокини. В някои контексти потиска IL-6 и TNF-α (противовъзпалително), в други (псориазис, лупус) ги повишава. Зависимостта от контекста е основната особеност на LL-37, която усложнява терапевтичната му употреба.

Заздравяване на рани чрез трансактивиране на EGFR

Tokumaru et al. (2005) показват, че LL-37 активира рецептора за епидермален растежен фактор (EGFR) в кератиноцитите, но индиректно. Механизмът е интересен. LL-37 задейства освобождаване на свързания с мембраната HB-EGF (хепарин-свързващ EGF-подобен растежен фактор) чрез активиране на металопротеинази (особено ADAM17), а освободеният HB-EGF след това активира EGFR автокринно или паракринно. Резултат: миграция и пролиферация на кератиноцитите, реепителизация на раната.

Heilborn et al. (2003) допълват тази картина с наблюдението, че експресията на LL-37 в епитела е понижена при хронични язви в сравнение с острите рани. Това води до хипотезата, че заместването на LL-37 би могло да възстанови капацитета за заздравяване. Тя е потвърдена в проучването фаза 1/2 на Gronberg.

Стимулиране на ангиогенезата

Чрез рецептора FPR2 върху ендотелните клетки LL-37 стимулира миграцията на ендотелни клетки и образуването на капилярни тубули. Този ангиогенен ефект е важен при заздравяването на исхемични тъкани (диабетни язви, изгаряния), но паралелно с това налага предпазливост в онкологичните модели, където нежеланата ангиогенеза подкрепя туморния растеж.

Изследвани приложения

Публикуваната предклинична и клинична литература документира ефектите на LL-37 в следните области:

• Антимикробна терапия на резистентни щамове (MRSA, VRE, мултирезистентна Pseudomonas)
• Заздравяване на хронични язви, данни от фаза 1/2 (Gronberg 2014)
• Диабетни язви в предклинични модели
• Изгаряния, подкрепа на реепителизацията
• Модели на сепсис чрез неутрализиране на LPS
• Кистозна фиброза и белодробни инфекции (Pseudomonas)
• Възпалителни чревни заболявания, болест на Crohn, улцерозен колит в животински модели
• Атопичен дерматит, при който ендогенният LL-37 е понижен
• Псориазис като медиатор на патологичен кръг (в този контекст LL-37 не е терапия, а мишена за потискане)
• Розацея, при която повишената експресия на каликреин 5 води до свръхпроизводство на LL-37
• Онкологични изследвания, апоптотични ефекти върху туморни клетки (зависими от контекста)
• Антивирусни изследвания, включително хипотетичен защитен ефект срещу SARS-CoV-2

Купуване на LL-37: на какво да обърнете внимание

При купуване на LL-37 решаващият критерий не е цената, а проверимостта на качеството. Един изследователски пептид струва точно толкова, колкото струва сертификатът му за анализ. Пазарът се простира от сериозни доставчици с лабораторни изпитвания до продавачи от сивия пазар без никаква документация, а лиофилизираният прах изглежда еднакво. Тези пет критерия ги разделят.

1. Сертификатът за анализ ще бъде предоставен със следващата партида

HPLC чистотата показва каква част от праха наистина е LL-37. Сериозните доставчици документират ≥ 99 % с хроматограма. „99 % чистота” без приложена хроматограма е твърдение, а не доказателство.

2. Партиден сертификат за анализ (CoA)

Най-важният документ. Партидният CoA принадлежи точно на партидата, която получавате, с номер на партида, дата и стойност на чистотата, издаден от независима лаборатория (Janoshik и подобни са индустриалният стандарт). Ако доставчик показва CoA само „при поискване” или общ образец, не купувайте оттам.

3. Потвърждаване на идентичността чрез LC-MS

Чистотата ви казва колко от дадено вещество има; LC-MS ви казва кое е веществото. Чрез молекулната маса (4493,3 Da) той потвърждава, че става дума за правилната идентичност на LL-37, а не за по-евтин, погрешно етикетиран пептид.

4. Произход и доставка от ЕС с проследимост

Доставчик със склад в ЕС и пълна проследимост на партидата има предимство пред сивия внос от Азия: по-кратък и охлаждан транспорт, без митнически риск. Molequa® изпраща от територията на ЕС, обикновено в рамките на 1 до 3 работни дни, без митнически забавяния след Brexit.

5. Правилна форма на доставка: лиофилизат

Качественият LL-37 се доставя като лиофилизат (бял прах), а не като предварително смесен разтвор. В лиофилизирано състояние той остава стабилен много по-дълго и се разтваря едва непосредствено преди употреба с бактериостатична вода.

Проверка на качеството за 30 секунди

• ✅ Публично достъпен ли е партидният CoA (а не само „при поискване”)?
• ✅ Доказана ли е чистотата с хроматограма?
• ✅ Потвърдена ли е идентичността чрез LC-MS (маса 4493,3 Da)?
• ✅ Има ли склад в ЕС и проследимост на партидата?
• ✅ Доставя ли се като лиофилизат с ясни указания за съхранение?

Ако и петте точки са изпълнени, купувате проверен материал. Всяка партида на Molequa® се изпраща с партиден сертификат за анализ и потвърждение чрез LC-MS, актуалния CoA ще намерите в раздела Резултати от изпитването на партидата по-долу.

Правна забележка: LL-37 е изследователски пептид и не е одобрено лекарство. Продава се изключително за научни лабораторни изследвания и не е предназначен за консумация от хора или животни.

Наука и проучвания

Ключови публикации

Sørensen O.E., et al. (1997). The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 90(7):2796-2803. Първоначално описание на биосинтезата и локализацията.

Nizet V., et al. (2001). Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 414(6862):454-457. In vivo доказателство за защитната функция в кожата.

Heilborn J.D., et al. (2003). The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 120(3):379-389. Ключово наблюдение за хроничните язви.

Tokumaru S., et al. (2005). Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175(7):4662-4668. Механизъм на трансактивиране на EGFR.

Lande R., et al. (2007). Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 449(7162):564-569. Двойствената природа на LL-37 при псориазис.

Carretero M., et al. (2008). In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 128(1):223-236. Изчерпателна валидация на ефекта върху заздравяването.

Gronberg A., et al. (2014). Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 22(5):613-621. Клинично изпитване фаза 1/2.

Подробни разгъващи се проучвания

Проучване 1: Sørensen 1997, първоначална характеристика

Цитат: Sørensen O.E., Follin P., Johnsen A.H., et al. The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 1997;90(7):2796-2803.

Какво са направили: Изолиране на hCAP-18 от човешки неутрофили, секвениране, идентифициране на мястото на синтез и на гранулната локализация. Използвани методи: хроматография, масспектрометрия, имунохистохимия на костен мозък, имуноелектронна микроскопия на неутрофили, in vitro разцепване с протеиназа 3 и характеризиране на C-краевия фрагмент LL-37.

Какво са открили:

• hCAP-18 се синтезира по време на миелоцитния и метамиелоцитния стадий от развитието на неутрофилите в костния мозък.
• Локализиран е в специфични гранули (вторични гранули), а не в първичните азурофилни гранули.
• При дегранулация hCAP-18 се освобождава извънклетъчно и протеиназа 3 (от азурофилните гранули) го разцепва протеолитично на про-домен и активен C-краеви фрагмент LL-37.
• LL-37 проявява антимикробна активност срещу E. coli и Staphylococcus aureus при микромоларни концентрации.
• Пълноверижният hCAP-18 (без разцепване) е биологично неактивен.

Защо това има значение: Това проучване дефинира биологията на LL-37 в човешкия организъм. Без откритието на Sørensen нямаше да знаем, че LL-37 е „скрит” предшественик в гранулната система на неутрофилите, активиран чрез контролирано ензимно разцепване. Всички последващи изследвания, включително терапевтичните опити за директно доставяне на синтетичен LL-37 без зависимост от протеиназа 3, стъпват върху това прозрение.

Проучване 2: Nizet 2001, in vivo защитна функция в кожата

Цитат: Nizet V., Ohtake T., Lauth X., et al. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 2001;414(6862):454-457.

Какво са направили: Използвали са мишки нокаут за кателицидин (CRAMP, миши еквивалент на LL-37), изложили са ги на кожно инокулиране със стрептокок от група A (Streptococcus pyogenes) и са ги сравнили с мишки от див тип. Оценили са размера на лезиите, бактериалния товар и хистологията.

Какво са открили:

• Нокаут мишките развили значително по-големи и по-инвазивни кожни лезии от контролите от див тип.
• Бактериалният товар в локалните тъкани бил 5 до 10 пъти по-висок при нокаут мишките.
• In vitro бактериите, изолирани от нокаут мишките, имали същата чувствителност към CRAMP като референтните щамове. Следователно дефектът бил в защитата на гостоприемника, а не в патогена.
• Допълването на екзогенен CRAMP в лезиите частично възстановило защитата при нокаут мишките.

Защо това има значение: Това е първото ясно in vivo доказателство, че кателицидинът е необходим за нормалната защита на кожата срещу бактериална инфекция. То издига LL-37 (и CRAMP при мишките) от ролята на „интересна in vitro молекула” до ключов компонент на вродения имунитет. Нокаут моделът остава златен стандарт за изучаване на ролята на антимикробните пептиди в различни тъкани.

Проучване 3: Heilborn 2003, дефицит на LL-37 при хронични язви

Цитат: Heilborn J.D., Nilsson M.F., Kratz G., et al. The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 2003;120(3):379-389.

Какво са направили: Имунохистохимичен анализ на биопсии от остри рани (хирургични рани 3 до 7 дни след разреза) и хронични рани (венозни язви, диабетни язви) при пациенти. Паралелно с това in vitro експеримент, в който блокирали LL-37 в ex vivo модел на кожна рана и оценили ефекта върху реепителизацията.

Какво са открили:

• При острите рани LL-37 е силно експресиран в мигриращите кератиноцити по ръба на раната, където активно протича реепителизация.
• При хроничните язви LL-37 почти липсва в епитела въпреки повишената бактериална колонизация (която нормално би индуцирала експресията му).
• In vitro блокирането на LL-37 с антитяло или антисенс олигонуклеотид спряло реепителизацията в ex vivo модела на кожна рана.
• Допълването на синтетичен LL-37 в модела възстановило реепителизацията при условия на блокада.

Защо това има значение: Heilborn и колеги свързват дефицита на ендогенен LL-37 с патофизиологията на хроничните рани. Това води до хипотезата, че заместването със синтетичен LL-37 би могло да бъде терапевтична стратегия при венозни язви, диабетни язви и други трудно заздравяващи дефекти. Тази хипотеза е клинично валидирана десет години по-късно в проучването фаза 1/2 на Gronberg.

Проучване 4: Tokumaru 2005, трансактивиране на EGFR в кератиноцити

Цитат: Tokumaru S., Sayama K., Shirakata Y., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 2005;175(7):4662-4668.

Какво са направили: Стимулиране на човешки кератиноцити с LL-37 в култура и оценка на:

• Миграция в тест с драскотина (scratch wound assay)
• Фосфорилиране на EGFR и на низходящите кинази (ERK1/2, Akt)
• Използване на инхибитор на EGFR (AG1478) и на инхибитори на металопротеинази (GM6001, TAPI-1)
• Освобождаване на HB-EGF от клетъчната повърхност

Какво са открили:

• LL-37 в концентрации от 1 до 10 µM силно стимулира миграцията на кератиноцитите в теста с драскотина.
• LL-37 индуцира фосфорилиране на EGFR в рамките на 5 до 15 минути, с последващо активиране на ERK1/2.
• Инхибиторът на EGFR AG1478 напълно блокира миграционния ефект на LL-37.
• Инхибиторът на ADAM металопротеиназите (TAPI-1) също блокира миграцията, което потвърждава, че EGFR се активира индиректно чрез отделяне на HB-EGF.
• LL-37 не се свързва директно с EGFR; механизмът е трансактивиране чрез зависимо от металопротеинази освобождаване на лиганд.

Защо това има значение: Проучването разкрива конкретния молекулен механизъм, по който LL-37 подкрепя заздравяването. От него следва, че LL-37 не е просто „антибиотик”, а и модулатор на растежни фактори, който задейства пътя на EGFR, един от най-важните пътища в епителната регенерация. Разбирането на този механизъм отваря вратата към по-нататъшни проучвания, комбиниращи LL-37 с екзогенни растежни фактори.

Проучване 5: Lande 2007, двойствена природа при псориазис

Цитат: Lande R., Gregorio J., Facchinetti V., et al. Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 2007;449(7162):564-569.

Какво са направили: Изследване на псориатична кожа и in vitro модел с плазмоцитоидни дендритни клетки (pDC). Въпросът: защо пациентите с псориазис, които имат повишени нива на LL-37 в кожата, парадоксално нямат по-добра защита от инфекции, а вместо това хронично възпаление? Експериментите включват:

• Имунофлуоресцентна локализация на LL-37 и собствена ДНК в псориатични лезии
• In vitro стимулиране на pDC с комбинации от LL-37 + ДНК от различни източници
• Измерване на производството на IFN-α от pDC
• Експерименти с потискане на TLR9

Какво са открили:

• В псориатичната кожа LL-37 е колокализиран със собствена ДНК, освободена от увредени кератиноцити.
• LL-37 свързва ДНК чрез катионни взаимодействия и я пренася в ендозомите на pDC.
• В ендозомата ДНК активира TLR9, който нормално не отговаря на собствена ДНК (защото тази ДНК е изолирана в ядрото и не достига до TLR9).
• Активираният TLR9 задейства масивно производство на интерферон α (IFN-α), движещата сила на псориатичното възпаление.
• Без LL-37 самата собствена ДНК не стимулира pDC. Комбинацията LL-37 + ДНК е качествено различен сигнал от всеки от двата поотделно.

Защо това има значение: Това е критична публикация, която всеки изследователски потребител на LL-37 трябва да познава. Тя показва, че LL-37 не е универсално „добър” пептид. В някои контексти (псориазис, лупус, определени автоимунни заболявания) той е медиатор на патология, а не лечение. От изследователска гледна точка това означава, че специфичността на контекста е по-важна при LL-37, отколкото при други пептиди. Не може просто да „приложите LL-37” и да очаквате защитен ефект. Зависи от тъканната среда, наличието на ДНК и вида на имунните клетки.

Проучване 6: Carretero 2008, изчерпателна валидация на ефекта върху заздравяването

Цитат: Carretero M., Escámez M.J., García M., et al. In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 2008;128(1):223-236.

Какво са направили: Изчерпателна експериментална програма, която свързва in vitro и in vivo данните:

• Стимулиране на човешки кератиноцити и фибробласти с LL-37, измерване на пролиферацията, миграцията и производството на матриксни белтъци.
• In vivo модел при мишки с ексцизионни кожни рани, локално прилагане на LL-37 в хидрогелна формулировка срещу контрола.
• Оценка на кинетиката на затваряне на раната, качеството на белега и капилярната плътност.
• Механистичен анализ на участието на рецептора FPR2.

Какво са открили:

• LL-37 в концентрации от 1 до 5 µM стимулирал пролиферацията на кератиноцитите с 30 до 60 % над изходното ниво и на фибробластите с 20 до 40 %.
• LL-37 силно стимулирал ангиогенезата в in vitro тест за образуване на тубули с ендотелни клетки (HUVEC).
• In vivo: мишките, третирани с LL-37, имали по-бързо затваряне на раната с 25 до 35 % в сравнение с контролата (дни 7 и 14).
• Капилярната плътност в заздравяващите рани била значително по-висока в групата с LL-37.
• Антагонистите на FPR2 частично блокирали ангиогенния и миграционния ефект на LL-37, което потвърждава участието на този рецептор.

Защо това има значение: Проучването на Carretero съчетава клетъчното, механистичното и in vivo нивото в последователна валидация на ефекта на LL-37 върху заздравяването. То изгражда доказателствената основа за клинично пренасяне и служи като една от основните референции в проучването фаза 1/2 на Gronberg няколко години по-късно.

Проучване 7: Gronberg 2014, клинично изпитване фаза 1/2 при заздравяване на венозни язви

Цитат: Gronberg A., Mahlapuu M., Stahle M., Whately-Smith C., Rollman O. Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 2014;22(5):613-621.

Какво са направили: Рандомизирано, плацебо-контролирано, двойно сляпо клинично изпитване фаза 1/2. Включени са пациенти с хронични венозни язви на подбедрицата, които не са отговорили на стандартните грижи. Рандомизация: локално прилагане на синтетичен LL-37 в хидрогелна формулировка в три дози (0,5, 1,6 и 3,2 mg/ml) срещу хидрогелно плацебо, два пъти седмично в продължение на 4 седмици. Проследяване 8 седмици. Оценка: безопасност, намаляване на размера на раната, микробна колонизация, локални реакции.

Какво са открили:

• Без сериозни нежелани събития, свързани с LL-37, в нито една група.
• Локалната поносимост била добра; леко парене при прилагане съобщили под 10 % от пациентите.
• Статистически значимо ускоряване на заздравяването в групите с 0,5 и 1,6 mg/ml LL-37 спрямо плацебо.
• Най-високата доза от 3,2 mg/ml парадоксално показала по-малък ефект, което сочи камбановидна крива доза-отговор (типично явление при имуномодулаторите).
• Бактериалният товар в раната не се променил значимо; следователно ефектът върху заздравяването не бил основно антимикробен, а регенеративен.

Защо това има значение: Това е първото и засега единствено публикувано рандомизирано клинично проучване на LL-37 при хора. То валидира концепцията за терапевтично допълване с LL-37 при индикацията хронични язви. Пълният регистрационен процес обаче не продължава. Шведската компания Pergamum AB, която спонсорира проучването, по-късно е придобита от Promore Pharma и клиничната програма за LL-37 претърпява допълнително преструктуриране. В изследователски контекст обаче проучването на Gronberg остава ключова референтна точка за безопасност и ефикасност на LL-37.

CoA, сертификат за анализ

Спецификация за качество (CoA с първата партида)

Стойностите по-долу са спецификацията за освобождаване, спрямо която се изпитва първата партида. Подписаният CoA ще бъде добавен веднага след издаването му.

• Чистота: ≥ 98,2 % (HPLC-UV при 220 nm)
• Идентичност: потвърдена чрез масспектрометрия (MS, ESI+, MW 4493,33 Da)
• Ендотоксини: < 1,0 EU/mg (LAL тест, измерване на замърсяване с бактериални токсини)
• Микробно замърсяване: отговаря на USP <61>
• Остатъчни разтворители: отговаря на ICH Q3C
• Остатъци от TFA: < 1,5 %
• Съдържание на пептид (AAA, аминокиселинен анализ): 75 до 85 % (останалото е сол и вода, типично за пептид с този размер)
• Вторична структура: потвърдена чрез CD спектроскопия (случайно нагъване в PBS, индуцируема α-спирала в 50 % TFE)
• Профил на сродните примеси: делеционни последователности и окислени форми < 0,5 % всяка

[Изтегляне на CoA (PDF)], [Изтегляне на SDS (PDF)]

Независима аналитична лаборатория (проверка от трета страна). Оригиналният производствен CoA е достъпен при поискване за B2B партньори.

Забележка за синтеза: LL-37 с 37 аминокиселини е почти пет пъти по-дълъг от типичен по-къс пептид в нашия каталог (например BPC-157 има 15 аа, AOD-9604 има 16 аа). Това означава значително повече синтетични стъпки, по-висок риск от делеционни последователности и по-взискателно пречистване. MOLEQUA прилага степенно HPLC пречистване (първи кръг за чистота, втори за обмен на соли) и проверява вторичната структура на всяка партида чрез CD спектроскопия. Именно затова LL-37 е сред продуктите ни от премиум класа.

Съхранение

Лиофилизат (сух прах преди разтваряне)

• 2 години при −20 °C (фризер)
• 18 месеца при 2 до 8 °C (хладилник)
• До 14 дни при стайна температура (до 25 °C), пазете от светлина и влага. LL-37 е по-чувствителен от по-късите пептиди, затова продължителното излагане на стайна температура не се препоръчва.

След разтваряне (пептид в разтвор с бактериостатична вода)

• До 30 дни при 2 до 8 °C, защитен от светлина
• LL-37 в разтвор е по-чувствителен от по-късите пептиди. Избягвайте кисели условия (pH < 4) и силно алкални условия (pH > 9), които ускоряват разграждането. Оптимално pH 5 до 7.

Практични правила за съхранение

• Оставете флакона да се стопли до стайна температура (15 до 20 мин) преди отваряне. Студен флакон и топъл въздух създават кондензация на влага вътре.
• LL-37 е амфипатичен пептид. При продължително съхранение в разтвор той може в малка степен да „полепва” по стъклените стени на флакона. Това е нормално явление; лекото завъртане освобождава пептида.
• Тъмнината е важна. LL-37 не съдържа триптофан (най-чувствителната ароматна аминокиселина), но съдържа фенилаланин и тирозин, които също реагират на UV светлина. Съхранявайте в тъмен флакон или кутия.
• Не разклащайте! Механичният стрес може да наруши вторичната структура и да подпомогне агрегацията (типичен проблем при амфипатичните пептиди).
• Разтворът трябва да остане бистър. Всяка мътнина сочи агрегация или замърсяване; не използвайте такава проба по-нататък.
• Избягвайте повторни цикли замразяване и размразяване. Ако разтваряте по-голям обем, разделете на аликвотни части и замразете еднократно при −20 °C или −80 °C.

Разтваряне (реконституция)

Визуално в 3 стъпки

1. Разтворете, като добавите бактериостатична вода по стената на флакона.
2. Измерете нужния обем с помощта на калкулатора (раздел 8).
3. Съхранявайте в хладилник при 2 до 8 °C, защитен от светлина.

Подробен протокол

Какво ще ви трябва:

• Флакон LL-37 (5 mg лиофилизат)
• 2 ml бактериостатична вода (съдържа 0,9 % бензилов алкохол, консервант, който предотвратява бактериалния растеж). Алтернативно стерилна вода за инжекции или 0,9 % NaCl, ако искате разтвор без консервант (по-кратка трайност).
• Инсулинова спринцовка 1 ml / 29G
• Тампон със спирт

Процедура:

1. Оставете флакона с LL-37 да достигне стайна температура (15 до 20 мин). Студен флакон и топла вода водят до кондензация, която нарушава стабилността на пептида.
2. Дезинфекцирайте гумените запушалки на двата флакона (пептид и BAC вода) с тампон със спирт. Оставете алкохола да се изпари.
3. Изтеглете нужния обем BAC вода в инсулиновата спринцовка. Стандартът за флакон от 5 mg е 2 ml, което дава концентрация 2,5 mg/ml.
4. Впръсквайте водата бавно по стената на флакона. Никога директно върху лиофилизата. Силната струя може да образува пяна и да предизвика агрегация на пептида.
5. Оставете флакона да престои 2 до 3 минути. LL-37 е по-дълга молекула и се разтваря по-бавно от по-малките пептиди. Дайте му време.
6. Завъртайте флакона леко с кръгови движения (НИКОГА не го разклащайте!) в продължение на 60 до 90 секунди, докато целият прах се разтвори. Ако все още виждате остатъчни частици, изчакайте още една минута и повторете. Разтворът трябва да бъде напълно бистър, без мътнина и без плаващи частици.
7. Съхранявайте в хладилник при 2 до 8 °C, защитен от светлина.

Алтернативни обеми за различни крайни концентрации

Правило: За LL-37 препоръчваме обем от 2 ml като оптимален компромис. При по-високи концентрации рискът от агрегация нараства; при по-ниски трайността на разтвора намалява. Ако работите с in vitro модели (клетъчни култури), можете да приготвите концентриран стоков разтвор (5 mg/ml) и да го разредите до работната концентрация в самия експеримент.

Пептиден калкулатор (интерактивен модул)

Входни данни:

• Маса на пептида във флакона: 5 mg (предварително попълнено)
• Обем вода за разтваряне: плъзгач от 1 до 10 ml
• Целева „доза” в изследователския протокол (mg или µg)

Изходни данни:

• Концентрация: __ mg/ml
• Обем на доза: __ ml
• Визуализация на инсулинова спринцовка: __ IU (по скала от 100 IU)

Пример (локално приложение в хидрогелна формулировка, еквивалентно на средната доза 1,6 mg/ml от Gronberg 2014): За приготвяне на разтвор 1,6 mg/ml: флакон от 5 mg плюс 3,1 ml BAC вода ≈ 1,6 mg/ml. При нанасяне на 0,5 ml върху раната това доставя 0,8 mg LL-37.

Пример (in vitro експеримент, целева концентрация 1 µM в 10 ml среда): 1 µM LL-37 в 10 ml среда = 1×10⁻⁶ mol/L × 4493 g/mol × 0,01 L = 45 µg. От стоков разтвор 2,5 mg/ml това съответства на 18 µl стоков разтвор в 10 ml среда.

Отказ от отговорност: Калкулаторът е предназначен единствено за изследователски изчисления при възпроизвеждане на публикувани протоколи. Той не е медицинско указание и не е препоръка за дозиране при хора.

Комбинации с пептиди, често комбинирани пептиди

LL-37 е преди всичко многофункционален пептид както с антимикробни, така и с регенеративни ефекти. В изследователските протоколи той се комбинира с пептиди, които допълват конкретни механизми.

BPC-157 и TB-500, заздравяване на рани и регенерация

Най-честата комбинация в изследователската литература за заздравяване на меки тъкани. BPC-157 подкрепя неоваскуларизацията чрез VEGFR2 и модулира NO синтазата. TB-500 (фрагмент на тимозин β4) подкрепя клетъчната миграция и преустройството на актина. LL-37 добавя антимикробна защитна среда и медиирана от EGFR миграция на кератиноцитите. Заедно те покриват васкуларизация, клетъчна миграция и антимикробна защита, три ключови компонента на заздравяването на хронични рани.

KPV, противовъзпалителен компонент за кожни индикации

KPV (Lys-Pro-Val, трипептиден фрагмент на α-MSH) има силни противовъзпалителни ефекти чрез меланокортиновата система и потискане на NF-κB. В комбинация с LL-37 той се изследва при атопичен дерматит, където LL-37 осигурява антимикробния компонент, а KPV потушава хроничното възпаление. При псориазис ситуацията е по-сложна; KPV може да е от полза, но LL-37 може да е контрапродуктивен (Lande 2007).

Тимозин α1, имуномодулаторна синергия

Тимозин α1 е пептид от 28 аминокиселини със сложна имуномодулаторна активност, включително подкрепа на съзряването на T-клетките и активиране на дендритните клетки чрез TLR9. Комбинацията с LL-37 се проучва за противоинфекциозни приложения (сепсис, тежки инфекции при имунокомпрометирани пациенти, определени вирусни инфекции). Двата пептида модулират вродения и придобития имунитет от различни ъгли.

GHK-Cu, дерматологична синергия

GHK-Cu (трипептид със свързана мед) е добре характеризиран в дерматологията и козметологията. Той стимулира синтеза на колаген и на гликозаминогликани и подкрепя преустройството на матрикса. В изследователски контекст се комбинира с LL-37 за регенерация на кожата след изгаряния, изследвания против стареене и подкрепа на заздравяването на белези. Механизмите са допълващи се: GHK-Cu на нивото на матрикса, LL-37 на нивото на кератиноцитите и на антимикробната защита.

Допълнителна забележка: предпазливост при автоимунни модели

В изследователски контекст на автоимунни заболявания (псориазис, лупус, определени форми на възпалителни чревни заболявания) комбинирането на LL-37 с други имунни активатори е противопоказано. В тези модели LL-37 може да допринесе за патогенезата чрез кръга TLR9-IFN-α (Lande 2007). Винаги първо проверявайте приложимостта на LL-37 в конкретния моделен контекст.

Доставка и опаковка

• Дискретна опаковка, без лога и без описание на съдържанието върху външната опаковка. Никой пощенски служител не знае какво сте поръчали.
• Packeta, Словакия 24 до 48 ч, ЕС в рамките на 3 дни
• Безплатна доставка над 80 € (в останалите случаи 4,90 €)
• Изпращане в рамките на 6 ч от потвърждаването на поръчката (поръчайте до 14:00 и изпращаме същия ден)
• Хладилна верига при съхранение до изпращане при 2 до 8 °C
• Лиофилизатите са стабилни при стайна температура до 30 дни, обичайният транспорт не влияе на качеството
• Като премиум пептид LL-37 се изпраща в здрава подплатена опаковка със защита от светлина

Отзиви

4,9 / 5 от 14 отзива

[Отзиви от потвърдени клиенти, подредени от най-новите]

MOLEQUA Peptides е нова марка на пазара. Отзивите се обновяват непрекъснато с разрастването на базата от изследователи и лаборатории, които работят с нас. Бъдете сред първите, които ще оценят качеството на нашите продукти.

[Бутон: Добавяне на отзив, само за потвърдени клиенти]

Свързани продукти

От категорията Имунитет и антимикробни пептиди:

• Тимозин α1, имуномодулаторен пептид, основен партньор за комбинации при противоинфекциозни приложения
• KPV, противовъзпалителен трипептид, дерматологична синергия (очаквайте скоро)

От категорията Регенерация и заздравяване (за комбинирани протоколи):

• BPC-157, гастропротективен пептид с проангиогенен ефект
• TB-500 (фрагмент на тимозин β4), клетъчна миграция и преустройство на актина
• GHK-Cu, регенеративен трипептид със свързана мед, дерматологично приложение

От категорията Премиум клас:

• Останалите премиум пептиди на MOLEQUA с разширен аналитичен контрол ще намерите в раздела „Премиум клас” на каталога.

Бюлетин

Останете в течение. Без спам. На всеки 2 седмици ще ви изпращаме: нови проучвания, обяснения за молекулите и ексклузивни отстъпки. Без ежедневни имейли. 10 % отстъпка за първата поръчка като добре дошли.

[Имейл] [Абониране]

Пълен отказ от отговорност

Отказ от отговорност. LL-37 и всички продукти на MOLEQUA Peptides са предназначени изключително за изследователски и научни цели. Те не са лекарство, хранителна добавка, козметичен продукт или храна. Не са предназначени за консумация от хора или животни. Продажбата е ограничена до квалифицирани изследователи, академични институции и лаборатории. Преди всякаква работа с продукта се запознайте със съответната научна литература и спазвайте приложимото законодателство във вашата юрисдикция. LL-37 няма одобрение като лекарство нито от FDA, нито от EMA. Единственото публикувано рандомизирано клинично проучване (Gronberg et al. 2014, фаза 1/2 при заздравяване на хронични венозни язви) демонстрира безопасност и ефикасност при локално приложение, но пълният регистрационен процес не е продължил. В автоимунен контекст (псориазис, лупус) LL-37 може да допринесе за патологията чрез активиране на оста TLR9 на плазмоцитоидните дендритни клетки (Lande et al. 2007), което трябва да се вземе предвид при дизайна на изследванията. MOLEQUA Peptides не носи отговорност за злоупотреба с продукта извън обявеното му предназначение.

Край на продукта LL-37.

Ключови научни данни и цитати

“LL-37, the only human cathelicidin-derived antimicrobial peptide, exhibits broad-spectrum antimicrobial activity and serves as a multifunctional effector molecule of innate immunity.”
Dürr UH., Sudheendra US., Ramamoorthy A. (2006), Biochim Biophys Acta 1758(9), PubMed 16716248

Статистика от предклиничната литература

• LL-37, човешкият кателицидинов антимикробен пептид, 37 аминокиселини, последователност, започваща с Leu-Leu (оттам и името), молекулна маса 4493,3 Da
• Кодиран от гена CAMP (хромозома 3p21.3), освобождава се от белтъка hCAP-18 чрез разцепване с протеиназа 3 в неутрофилите
• Идентифициран от групата на Birgitta Agerberth (Karolinska Institutet, Швеция) през 1995 г.
• Стандартна експериментална концентрация: 1–10 μg/ml in vitro за антимикробни тестове (E. coli, S. aureus, C. albicans)
• Механизъм: пряка пермеабилизация на бактериалната мембрана (катионна амфипатична α-спирала), модулация на FPR2/ALX, P2X7, GPCR, индукция на ангиогенеза и реепителизация
• MIC срещу E. coli: около 5 μM (Travis et al. 2000); срещу S. aureus: около 10–20 μM
• 4 одобрени терапевтични производни, идентифицирани в разработване (Pexiganan, Omiganan, Iseganan, всички с неуспех във фаза 2/3)
• Приблизително 3000+ публикации в PubMed (1995–2024), крайъгълен пептид на вродения имунитет

Референтни източници (PubMed)

1. Agerberth B. et al. (1995). “FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis.” Proc Natl Acad Sci USA 92(1):195–199. PubMed 7529412
2. Dürr UH. et al. (2006). “LL-37, the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides.” Biochim Biophys Acta 1758(9):1408–1425. PubMed 16716248
3. Vandamme D. et al. (2012). “A comprehensive summary of LL-37, the factotum human cathelicidin peptide.” Cell Immunol 280(1):22–35. PubMed 23246832

Регулаторен статус: LL-37 не е одобрен лекарствен продукт за хуманна употреба в нито една регулаторна зона (FDA, EMA, ŠÚKL). Производните в разработване (Pexiganan/MSI-78, Omiganan) са преминали клинични изпитвания фаза 2/3 за локални приложения (диабетно стъпало, розацея), но не са получили регулаторно одобрение. Съществуващите данни за самия LL-37 произхождат от предклинична и in vitro литература. Продуктът се продава строго за лабораторни научни изследвания (RUO).

Често задавани въпроси за LL-37

Тези въпроси отговарят на най-честите търсения за LL-37 в изследователски контекст. За пълната техническа документация вижте разделите по-горе.

Какво представлява LL-37 и за какво се използва в изследванията?

LL-37 (последователност LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES, 37 аминокиселини, 4493 Da) е единственият човешки кателицидинов антимикробен пептид, произхождащ от предшественика hCAP-18. В изследванията той проявява пряка бактерицидна активност (чрез пермеабилизация на мембраната), имуномодулация и подкрепа на заздравяването на рани. Изучава се в модели на хронични инфекции, кистозна фиброза и дерматологични заболявания.

Каква концентрация LL-37 използват учените в животински модели?

В предклинични животински модели LL-37 се изпитва локално в концентрации от 10 до 100 µg/ml или системно при 0,5 до 5 mg/kg интраперитонеално. Клиничните формулировки (OP-145, офталмологични препарати, фаза 2) изпитват значително по-ниски дози, за да се сведе до минимум цитотоксичността.

Каква е разликата между LL-37 и тимозин α1?

LL-37 и тимозин α1 са имуномодулаторни пептиди, но LL-37 е насочен към пряката антимикробна защита (вроден имунитет, бактерицидна активност), докато тимозин α1 модулира придобития имунитет чрез T-клетките и сигнализацията през TLR. LL-37 има собствена бактерицидна активност, тимозин α1 няма.

LL-37 одобрено лекарство ли е, или изследователско вещество?

LL-37 не е одобрено лекарство за хуманна употреба. Няколко производни (OP-145, омиганан) са преминали изпитвания фаза 2/3, но нито едно не е получило одобрение от EMA или FDA. Продуктът се продава строго за лабораторни научни изследвания (RUO), не за клинична употреба.

Как се съхранява и разтваря LL-37?

Лиофилизираният LL-37 трябва да се съхранява при −20 °C, защитен от светлина, стабилност 2 до 3 години; при 2 до 8 °C 6 месеца. LL-37 е амфипатичен, разтваряйте го в стерилна вода без детергенти, разтворът е стабилен 14 дни при 2 до 8 °C. Избягвайте повторни цикли замразяване и размразяване.

Какъв е полуживотът на LL-37 и колко често се прилага в проучванията?

LL-37 има кратък плазмен полуживот (около 30 минути) поради бърза протеолиза. В тъканите (където е свързан с биофилм или клетъчни мембрани) ефектът се задържа часове. Експерименталните протоколи използват 2 до 3 приложения дневно в системните проучвания.

Къде да купите LL-37 в ЕС за научни изследвания?

LL-37 за научни изследвания в ЕС се предлага от Molequa® с доставка чрез FedEx за 1 до 3 работни дни в Словакия, Чехия и ЕС. Продуктът се изпраща лиофилизиран със сертификат за анализ (COA), HPLC чистота ≥ 98 %. Продуктът е строго за лабораторни научни изследвания (RUO).