LL-37

Overblik

Hvor det kommer fra, og hvorfor det blev udviklet

LL-37 er ikke et »designerpeptid« i streng forstand. Det er et fragment af et humant immunmolekyle, som du bærer i hver eneste neutrofil, i hvert stykke hud og i hver epitelbeklædning. Derfor begyndte den første karakterisering ikke i et laboratorium for computerbaseret design, men i blodet.

I 1995 isolerede et dansk hold omkring Niels Borregaard (Rigshospitalet, København) fra humane neutrofiler et molekyle, som de kaldte hCAP-18 (human cationic antimicrobial protein, 18 kDa). Det tilhørte familien af cathelicidiner, et evolutionært ældgammelt forsvarssystem hos pattedyr, som vi deler med hunde, køer, grise og mus. Hos mennesker findes der kun ét cathelicidin, kodet af genet CAMP på kromosom 3p21.3.

Yderligere analyser viste, at den biologisk aktive del af hCAP-18 sidder i C-terminalen og adskilles fra prodomænet ved proteolytisk spaltning. Det enzym, der står for spaltningen, er proteinase 3 fra neutrofilernes azurofile granula. Det resulterende fragment har 37 aminosyrer og begynder med to leuciner (deraf »LL«), og betegnelsen LL-37 var født.

Ole Sørensen og kolleger fra samme miljø publicerede nøgleartiklen om biosyntesen i 1997 (Blood). Siden da har LL-37 været blandt de mest undersøgte humane antimikrobielle peptider i litteraturen med flere tusinde indekserede publikationer.

Hvorfor forskningsmiljøet interesserer sig så meget for LL-37

Der er tre hovedårsager til, at LL-37 skiller sig ud fra mængden af peptider:

1. Antibiotikaresistens. Klassiske antibiotika virker ved at hæmme bestemte enzymatiske trin (peptidoglykansyntese, proteinsyntese, DNA-replikation). Bakterier har udviklet resistens mod dem via mutationer i målet, effluxpumper eller enzymatisk nedbrydning. LL-37 virker helt anderledes. Det angriber den fysiske integritet af bakteriemembranen. Denne mekanisme er langt sværere at omgå ved mutation, og derfor undersøges LL-37 (og beslægtede peptider) som en forskningsretning over for resistente stammer som MRSA, VRE eller multiresistent Pseudomonas.

2. Kroniske sår. I kroniske venøse sår, diabetiske sår og forbrændinger er niveauet af endogent LL-37 i epitelet nedsat (Heilborn 2003). I et randomiseret, placebokontrolleret klinisk studie (Gronberg 2014) var lokal påføring af LL-37 i svært helende venøse bensår forbundet med hurtigere reduktion af sårarealet end placebo. Den beskrevne mekanisme omfatter samtidig stimulering af keratinocytter, neoangiogenese og antimikrobiel aktivitet, tre processer, der alle indgår i sårheling.

3. Immunmodulerende tveægget natur. Det er den ærlige side, som sjældent ses i markedsføringstekster. LL-37 er ikke »universelt gavnligt«. Ved psoriasis har man fundet, at LL-37 binder kroppens eget DNA fra beskadigede celler og danner et kompleks, der aktiverer plasmacytoide dendritiske celler via TLR9 (Lande 2007). Der opstår en proinflammatorisk sløjfe, som opretholder den kroniske psoriasistilstand. LL-37 i psoriatisk hud er derfor en mediator af sygdommen, ikke et lægemiddel. Den kompleksitet skal du forstå, når du arbejder med peptidet.

Virkningsmekanisme: hvad det gør på celleniveau

LL-37 er et sjældent eksempel på et peptid med flere parallelle mekanismer. Det er ikke et molekyle af typen »ét mål, én effekt«, men snarere et modulært værktøj i det medfødte immunforsvar.

Direkte antimikrobiel aktivitet via membranforstyrrelse

LL-37 er kationisk (nettoladning +6 ved fysiologisk pH) og amfipatisk (den ene side af α-helixen er hydrofob, den anden hydrofil). Bakteriemembraner har negativt ladede fosfolipider i det ydre lag (især phosphatidylglycerol hos grampositive bakterier og lipopolysakkarid hos gramnegative). Eukaryote membraner har overvejende neutralt phosphatidylcholin i det ydre lag.

Det er selektivitetsprincippet. LL-37 tiltrækkes elektrostatisk af bakteriemembranen, foldes lokalt til en α-helixstruktur og indlejres som amfipatisk helix i lipiddobbeltlaget. Ved tilstrækkelig koncentration danner det transmembrane porer (den såkaldte »barrel-stave«- eller »toroidal pore«-mekanisme). Bakteriecellen mister sin ionhomeostase, lyserer osmotisk og dør.

Aktivitetsspektret er meget bredt:

• Grampositive bakterier, herunder MRSA, VRE og Streptococcus pyogenes
• Gramnegative bakterier, herunder E. coli, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella
• Mykobakterier, herunder delvis aktivitet mod M. tuberculosis in vitro
• Kappebærende virus: HSV-1, HSV-2, HIV, RSV og influenza; en mulig effekt mod SARS-CoV-2 via forstyrrelse af virushylsteret er blevet foreslået, men ikke påvist
• Svampe, især Candida albicans

Immunmodulation, neutralisering af LPS og modulering af cytokiner

LL-37 gør en anden ting, som i forbindelse med sepsis og kronisk inflammation måske er endnu vigtigere end den direkte antimikrobielle aktivitet. Det binder lipopolysakkarid (LPS), endotoksinet fra gramnegative bakterier, og neutraliserer dets evne til at aktivere TLR4 på makrofager. I sepsismodeller betyder det, at LL-37 ikke kun dræber bakterier, men også dæmper det proinflammatoriske respons, som ellers fører til septisk shock.

Via receptoren FPR2/ALX (formylpeptidreceptor 2, som også binder lipoxin A4) aktiverer LL-37 kemotaksi af:

• Neutrofiler
• Monocytter
• T-lymfocytter
• Mastceller

Samtidig modulerer det cytokinproduktionen. I nogle sammenhænge dæmper det IL-6 og TNF-α (antiinflammatorisk), i andre (psoriasis, lupus) øger det dem. Kontekstafhængigheden er LL-37’s vigtigste kendetegn og komplicerer enhver terapeutisk anvendelse.

Sårheling via transaktivering af EGFR

Tokumaru et al. (2005) viste, at LL-37 aktiverer den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) i keratinocytter, men indirekte. Mekanismen er interessant. LL-37 udløser frigivelse af membranbundet HB-EGF (heparin-binding EGF-like growth factor) ved at aktivere metalloproteinaser (især ADAM17), og det frigivne HB-EGF aktiverer derefter EGFR autokrint eller parakrint. Resultat i modellen: migration og proliferation af keratinocytter og reepitelisering af såret.

Heilborn et al. (2003) supplerede billedet med iagttagelsen af, at ekspressionen af LL-37 i epitelet er nedsat i kroniske sår sammenlignet med akutte sår. Det førte til hypotesen om, at tilførsel af LL-37 kunne genoprette helingsevnen. Hypotesen blev afprøvet i Gronbergs fase 1/2-studie.

Stimulering af angiogenese

Via FPR2-receptoren på endotelceller stimulerer LL-37 migration af endotelceller og dannelse af kapillærrør. Den angiogene effekt undersøges i modeller for heling af iskæmisk væv (diabetiske sår, forbrændinger), men giver samtidig anledning til forsigtighed i onkologiske modeller, hvor uønsket angiogenese fremmer tumorvækst.

Undersøgte anvendelsesområder

Den publicerede prækliniske og kliniske litteratur undersøger LL-37 inden for følgende områder:

• Antimikrobiel aktivitet mod resistente stammer (MRSA, VRE, multiresistent Pseudomonas)
• Kroniske sår, fase 1/2-data (Gronberg 2014)
• Diabetiske sår i prækliniske modeller
• Forbrændinger, reepitelisering
• Sepsismodeller via neutralisering af LPS
• Cystisk fibrose og lungeinfektioner (Pseudomonas)
• IBD, Crohns sygdom og colitis ulcerosa i dyremodeller
• Atopisk dermatitis, hvor endogent LL-37 er nedsat
• Psoriasis som mediator af en patologisk sløjfe (i denne sammenhæng er LL-37 ikke en behandling, men et mål for hæmning)
• Rosacea, hvor øget ekspression af kallikrein 5 fører til overproduktion af LL-37
• Onkologisk forskning, apoptotiske effekter på tumorceller (kontekstafhængige)
• Antiviral forskning, herunder en hypotetisk beskyttende effekt mod SARS-CoV-2

Køb af LL-37: hvad du skal se efter

Når du køber LL-37, er det afgørende kriterium ikke prisen, men hvor godt kvaliteten kan verificeres. Et forskningspeptid er aldrig bedre end sit analysecertifikat. Markedet spænder fra seriøse, laboratorietestede leverandører til sælgere på det grå marked uden nogen dokumentation overhovedet – og det frysetørrede pulver ser helt ens ud. Disse fem kriterier skiller dem ad.

1. HPLC-renhed: analysecertifikatet offentliggøres med første batch

Renheden af LL-37 er indtil videre deklareret (≥ 99 %); analysecertifikatet fra Analyton Labs offentliggøres med første batch. HPLC-renheden viser, hvor stor en del af pulveret der faktisk er LL-37. Seriøse leverandører dokumenterer ≥ 99 % med et kromatogram. »99 % renhed« uden vedlagt kromatogram er en påstand, ikke et bevis.

2. Batchspecifikt analysecertifikat (CoA)

Det vigtigste dokument. Et batchspecifikt CoA hører til præcis den batch, du modtager – med batchnummer, dato og renhedsværdi, udstedt af et uafhængigt laboratorium (for eksempel Analyton Labs). Hvis en leverandør kun viser et CoA »på forespørgsel« eller et generisk eksempel, så køb ikke der.

3. Identitetsbekræftelse med LC-MS

Renheden fortæller dig, hvor meget af et stof der er til stede; LC-MS fortæller, hvilket stof det er. Via molekylmassen (4.493,3 Da) bekræfter metoden, at der er tale om LL-37 og ikke et billigere, fejlmærket peptid.

4. Oprindelse og forsendelse fra EU med sporbarhed

En leverandør med lager i EU og fuld batchsporbarhed har en fordel frem for gråimport fra Asien: kortere transport og ingen toldrisiko. Molequa® sender fra EU med FedEx direkte til døren i Danmark, typisk inden for 3 til 5 hverdage – uden told, fordi forsendelsen ikke forlader EU.

5. Korrekt leveringsform: lyofilisat

LL-37 af høj kvalitet leveres som lyofilisat (hvidt pulver), ikke som en færdigblandet opløsning. I frysetørret form holder det sig stabilt meget længere og rekonstitueres først lige før brug med bakteriostatisk vand.

Tjek kvaliteten på 30 sekunder

• ✅ Er et batchspecifikt CoA offentligt tilgængeligt (ikke kun »på forespørgsel«)?
• ✅ Er renheden dokumenteret med et kromatogram?
• ✅ Er identiteten bekræftet med LC-MS (masse 4.493,3 Da)?
• ✅ Lager i EU og batchsporbarhed?
• ✅ Leveres det som lyofilisat med klar vejledning om opbevaring?

Hvis alle fem punkter er opfyldt, køber du verificeret materiale. For LL-37 er renheden indtil videre deklareret: analysecertifikatet fra Analyton Labs offentliggøres med første batch, og certifikatstatus står altid på produktsiden. Alle offentliggjorte certifikater finder du i certifikatregistret.

Juridisk bemærkning: LL-37 er et forskningspeptid og er ikke et godkendt lægemiddel. Det sælges udelukkende til videnskabelig laboratorieforskning og er ikke beregnet til brug på mennesker eller dyr.

Videnskab og studier

Centrale publikationer

Sørensen O.E., et al. (1997). The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 90(7):2796-2803. Den oprindelige beskrivelse af biosyntese og lokalisering.

Nizet V., et al. (2001). Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 414(6862):454-457. In vivo-evidens for en beskyttende funktion i huden.

Heilborn J.D., et al. (2003). The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 120(3):379-389. Nøgleiagttagelsen om kroniske sår.

Tokumaru S., et al. (2005). Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175(7):4662-4668. Mekanismen bag transaktivering af EGFR.

Lande R., et al. (2007). Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 449(7162):564-569. LL-37’s tveæggede natur ved psoriasis.

Carretero M., et al. (2008). In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 128(1):223-236. Omfattende validering af den sårhelende effekt i modeller.

Gronberg A., et al. (2014). Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 22(5):613-621. Klinisk fase 1/2-forsøg.

Detaljerede studier

Studie 1: Sørensen 1997, den oprindelige karakterisering

Kilde: Sørensen O.E., Follin P., Johnsen A.H., et al. The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 1997;90(7):2796-2803.

Hvad de gjorde: Isolering af hCAP-18 fra humane neutrofiler, sekventering samt identifikation af syntesested og granulær lokalisering. Anvendte metoder: kromatografi, massespektrometri, immunhistokemi på knoglemarv, immunelektronmikroskopi af neutrofiler, in vitro-spaltning med proteinase 3 og karakterisering af det C-terminale LL-37-fragment.

Hvad de fandt:

• hCAP-18 syntetiseres i myelocyt- og metamyelocytstadiet af neutrofilernes udvikling i knoglemarven.
• Det er lokaliseret i specifikke granula (sekundære granula), ikke i de primære azurofile granula.
• Ved degranulering frigives hCAP-18 ekstracellulært, og proteinase 3 (fra de azurofile granula) spalter det proteolytisk i prodomænet og det aktive C-terminale LL-37-fragment.
• LL-37 udviser antimikrobiel aktivitet mod E. coli og Staphylococcus aureus ved mikromolære koncentrationer.
• Det fulde hCAP-18 (uspaltet) er biologisk inaktivt.

Hvorfor det er vigtigt: Studiet definerede LL-37’s biologi i menneskekroppen. Uden Sørensens opdagelse ville vi ikke vide, at LL-37 er en »skjult« forløber i neutrofilernes granulasystem, som aktiveres ved kontrolleret enzymatisk spaltning. Al senere forskning, herunder terapeutiske forsøg på at tilføre syntetisk LL-37 direkte uden afhængighed af proteinase 3, bygger på denne indsigt.

Studie 2: Nizet 2001, beskyttende funktion i huden in vivo

Kilde: Nizet V., Ohtake T., Lauth X., et al. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 2001;414(6862):454-457.

Hvad de gjorde: De brugte knockout-mus uden cathelicidin (CRAMP, musens modstykke til LL-37), udsatte dem for kutan inokulation med gruppe A-streptokokker (Streptococcus pyogenes) og sammenlignede dem med vildtypemus. De vurderede læsionernes størrelse, bakteriemængde og histologi.

Hvad de fandt:

• Knockout-musene udviklede markant større og mere invasive hudlæsioner end vildtypekontrollerne.
• Bakteriemængden i det lokale væv var 5 til 10 gange højere hos knockout-musene.
• In vitro havde bakterier isoleret fra knockout-mus samme følsomhed over for CRAMP som referencestammer. Defekten lå altså i værtens forsvar, ikke i patogenet.
• Tilførsel af eksogent CRAMP i læsionerne genoprettede delvist beskyttelsen hos knockout-musene.

Hvorfor det er vigtigt: Det var det første klare in vivo-bevis for, at cathelicidin er nødvendigt for hudens normale forsvar mod bakterieinfektion. Det løftede LL-37 (og CRAMP hos mus) fra rollen som »interessant in vitro-molekyle« til en nøglekomponent i det medfødte immunforsvar. Knockout-modellen er fortsat guldstandarden til at studere AMP’ers roller i forskellige væv.

Studie 3: Heilborn 2003, mangel på LL-37 i kroniske sår

Kilde: Heilborn J.D., Nilsson M.F., Kratz G., et al. The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 2003;120(3):379-389.

Hvad de gjorde: Immunhistokemisk analyse af biopsier fra akutte sår (kirurgiske sår 3 til 7 dage efter incision) og kroniske sår (venøse sår, diabetiske sår) hos patienter. Parallelt et in vitro-forsøg, hvor de blokerede LL-37 i en ex vivo-model af hudsår og vurderede effekten på reepiteliseringen.

Hvad de fandt:

• I akutte sår udtrykkes LL-37 kraftigt i migrerende keratinocytter ved sårkanten, hvor reepiteliseringen aktivt finder sted.
• I kroniske sår er LL-37 næsten fraværende i epitelet, trods øget bakteriel kolonisering (som normalt ville inducere dets ekspression).
• Blokering af LL-37 in vitro med antistof eller antisense-oligonukleotid standsede reepiteliseringen i ex vivo-modellen.
• Tilførsel af syntetisk LL-37 til modellen genoprettede reepiteliseringen under blokeringen.

Hvorfor det er vigtigt: Heilborn og kolleger forbandt manglen på endogent LL-37 med patofysiologien bag kroniske sår. Det førte til hypotesen om, at tilførsel af syntetisk LL-37 kunne være en terapeutisk strategi ved venøse sår, diabetiske sår og andre svært helende defekter. Hypotesen blev afprøvet klinisk godt ti år senere i Gronbergs fase 1/2-studie.

Studie 4: Tokumaru 2005, transaktivering af EGFR i keratinocytter

Kilde: Tokumaru S., Sayama K., Shirakata Y., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 2005;175(7):4662-4668.

Hvad de gjorde: Stimulering af humane keratinocytter med LL-37 i kultur og vurdering af:

• Migration i et scratch-assay (ridseassay)
• Fosforylering af EGFR og nedstrøms kinaser (ERK1/2, Akt)
• Brug af en EGFR-hæmmer (AG1478) og metalloproteinasehæmmere (GM6001, TAPI-1)
• Frigivelse af HB-EGF fra celleoverfladen

Hvad de fandt:

• LL-37 i koncentrationer på 1 til 10 µM stimulerer kraftigt keratinocytmigrationen i scratch-assayet.
• LL-37 inducerer fosforylering af EGFR inden for 5 til 15 minutter med nedstrøms aktivering af ERK1/2.
• EGFR-hæmmeren AG1478 blokerer fuldstændigt den migrationsfremmende effekt af LL-37.
• ADAM-metalloproteinasehæmmeren (TAPI-1) blokerer også migrationen, hvilket bekræfter, at EGFR aktiveres indirekte via frigørelse (shedding) af HB-EGF.
• LL-37 binder ikke direkte til EGFR; mekanismen er transaktivering via metalloproteinaseafhængig frigivelse af ligand.

Hvorfor det er vigtigt: Studiet afslørede den konkrete molekylære mekanisme, hvormed LL-37 fremmer keratinocytmigration i modellen. Heraf følger, at LL-37 ikke bare er et »antibiotikum«, men også en modulator af vækstfaktorsignalering, der aktiverer EGFR-vejen, en af de vigtigste veje i epitelregenerering. Forståelsen af mekanismen åbnede døren for yderligere studier, der kombinerer LL-37 med eksogene vækstfaktorer.

Studie 5: Lande 2007, den tveæggede natur ved psoriasis

Kilde: Lande R., Gregorio J., Facchinetti V., et al. Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 2007;449(7162):564-569.

Hvad de gjorde: Undersøgelse af psoriatisk hud og en in vitro-model med plasmacytoide dendritiske celler (pDC). Spørgsmålet: hvorfor har psoriasispatienter, som har forhøjede niveauer af LL-37 i huden, paradoksalt nok ikke bedre beskyttelse mod infektion, men derimod kronisk inflammation? Forsøgene omfattede:

• Immunfluorescens-lokalisering af LL-37 og kroppens eget DNA i psoriatiske læsioner
• In vitro-stimulering af pDC med kombinationer af LL-37 + DNA fra forskellige kilder
• Måling af pDC’s produktion af IFN-α
• Forsøg med hæmning af TLR9

Hvad de fandt:

• I psoriatisk hud er LL-37 kolokaliseret med kroppens eget DNA, der frigives fra beskadigede keratinocytter.
• LL-37 binder DNA via kationiske interaktioner og transporterer det ind i pDC’s endosomer.
• I endosomet aktiverer DNA’et TLR9, som normalt ikke reagerer på kroppens eget DNA (fordi dette DNA er afskærmet i cellekernen og ikke når TLR9).
• Aktiveret TLR9 udløser en massiv produktion af interferon α (IFN-α), drivkraften i den psoriatiske inflammation.
• Uden LL-37 stimulerer eget DNA alene ikke pDC. Kombinationen LL-37 + DNA er et kvalitativt andet signal end hver af dem alene.

Hvorfor det er vigtigt: Det er en kritisk publikation, som enhver forsker, der arbejder med LL-37, bør kende. Den viser, at LL-37 ikke er et universelt »godt« peptid. I nogle sammenhænge (psoriasis, lupus, visse autoimmune sygdomme) er det en mediator af patologi, ikke en behandling. Set fra forskningens side betyder det, at kontekstspecificitet er vigtigere for LL-37 end for andre peptider. Man kan ikke bare »tilføre LL-37« og forvente en beskyttende effekt. Det afhænger af vævsmiljøet, tilstedeværelsen af DNA og typen af immunceller.

Studie 6: Carretero 2008, omfattende validering af helingseffekten

Kilde: Carretero M., Escámez M.J., García M., et al. In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 2008;128(1):223-236.

Hvad de gjorde: Et omfattende eksperimentelt program, der forbandt in vitro- og in vivo-data:

• Stimulering af humane keratinocytter og fibroblaster med LL-37 og måling af proliferation, migration og produktion af matrixproteiner.
• In vivo-model med excisionssår i huden på mus og lokal påføring af LL-37 i en hydrogelformulering over for kontrol.
• Vurdering af sårlukningens kinetik, arvævets kvalitet og kapillærtæthed.
• Mekanistisk analyse af FPR2-receptorens involvering.

Hvad de fandt:

• LL-37 i koncentrationer på 1 til 5 µM stimulerede proliferationen af keratinocytter med 30 til 60 % over udgangsniveauet og af fibroblaster med 20 til 40 %.
• LL-37 stimulerede angiogenesen kraftigt i et in vitro-assay for rørdannelse med endotelceller (HUVEC).
• In vivo: mus behandlet med LL-37 havde 25 til 35 % hurtigere sårlukning sammenlignet med kontrol (dag 7 og 14).
• Kapillærtætheden i de helende sår var signifikant højere i LL-37-gruppen.
• FPR2-antagonister blokerede delvist den angiogene og migrationsfremmende effekt af LL-37, hvilket bekræfter receptorens involvering.

Hvorfor det er vigtigt: Carreteros studie samlede det cellulære, det mekanistiske og in vivo-niveauet i en sammenhængende validering af LL-37’s sårhelende effekt i modeller. Det lagde evidensgrundlaget for klinisk translation og blev en af hovedreferencerne for Gronbergs fase 1/2-studie nogle år senere.

Studie 7: Gronberg 2014, klinisk fase 1/2-forsøg med heling af venøse sår

Kilde: Gronberg A., Mahlapuu M., Stahle M., Whately-Smith C., Rollman O. Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 2014;22(5):613-621.

Hvad de gjorde: Randomiseret, placebokontrolleret, dobbeltblindet klinisk fase 1/2-forsøg. Der indgik patienter med kroniske venøse bensår, som ikke havde reageret på standardbehandling. Randomisering: lokal påføring af syntetisk LL-37 i en hydrogelformulering i tre forskellige koncentrationer over for hydrogel-placebo i 4 uger. Opfølgning i 8 uger. Vurdering: sikkerhed, reduktion af sårstørrelse, mikrobiel kolonisering og lokale reaktioner.

Hvad de fandt:

• Ingen alvorlige bivirkninger relateret til LL-37 i nogen gruppe.
• Den lokale tolerabilitet var god; let svie ved påføring blev rapporteret af < 10 % af patienterne.
• Statistisk signifikant hurtigere heling i de to laveste LL-37-koncentrationsgrupper over for placebo.
• Den højeste koncentration viste paradoksalt nok en mindre effekt, hvilket peger på en klokkeformet dosis-respons-kurve (et typisk fænomen for immunmodulatorer).
• Bakteriemængden i såret ændrede sig ikke signifikant; helingseffekten var altså ikke primært antimikrobiel, men regenerativ.

Hvorfor det er vigtigt: Det er det første publicerede randomiserede kliniske studie med LL-37 på mennesker. Det afprøvede konceptet med lokal påføring af LL-37 ved svært helende venøse bensår. Den fulde registreringsproces blev dog ikke gennemført. Det svenske selskab Pergamum AB, som sponsorerede studiet, blev senere overtaget af Promore Pharma, og det kliniske LL-37-program gennemgik yderligere omstruktureringer. I forskningssammenhæng er Gronbergs studie dog fortsat et centralt klinisk referencepunkt for LL-37.

CoA, analysecertifikat

Kvalitetsspecifikation (CoA med første batch)

Værdierne nedenfor er den frigivelsesspecifikation, som den første batch testes mod. Det underskrevne CoA tilføjes, så snart det er udstedt.

• Renhed: ≥ 99 % (HPLC-UV ved 220 nm)
• Identitet: bekræftet ved massespektrometri (MS, ESI+, MW 4.493,33 Da)
• Endotoksiner: < 1,0 EU/mg (LAL-test, måling af kontaminering med bakterielle toksiner)
• Mikrobiel kontaminering: opfylder USP <61>
• Restopløsningsmidler: opfylder ICH Q3C
• TFA-rester: < 1,5 %
• Peptidindhold (AAA, aminosyreanalyse): 75 til 85 % (resten er salt og vand, typisk for et peptid af denne størrelse)
• Sekundærstruktur: bekræftet ved CD-spektroskopi (random coil i PBS, inducerbar α-helix i 50 % TFE)
• Profil for beslægtede urenheder: deletionssekvenser og oxiderede former < 0,5 % hver

Analysecertifikatet fra det uafhængige laboratorium Analyton Labs offentliggøres med den første batch. Indtil da er værdierne ovenfor en specifikation, ikke målte resultater.

Bemærkning om syntesen: LL-37 med 37 aminosyrer er mere end dobbelt så langt som de kortere peptider i vores katalog (f.eks. har BPC-157 15 aa og AOD-9604 16 aa). Det betyder markant flere syntesetrin, højere risiko for deletionssekvenser og en mere krævende oprensning. Derfor skal identitet og renhed dokumenteres særlig omhyggeligt, og derfor hører LL-37 til de dyrere peptider i kataloget.

Opbevaring

Lyofilisat (tørt pulver før rekonstitution)

• 2 år ved −20 °C (fryser)
• 18 måneder ved 2 til 8 °C (køleskab)
• Op til 14 dage ved stuetemperatur (op til 25 °C), beskyttet mod lys og fugt. LL-37 er mere følsomt end kortere peptider, så længere tids ophold ved stuetemperatur anbefales ikke.

Efter rekonstitution (peptid i opløsning med bakteriostatisk vand)

• Op til 30 dage ved 2 til 8 °C, beskyttet mod lys
• LL-37 i opløsning er mere følsomt end kortere peptider. Undgå sure forhold (pH < 4) og stærkt basiske forhold (pH > 9), som fremskynder nedbrydningen. Optimal pH er 5 til 7.

Praktiske regler for opbevaring

• Lad hætteglasset nå stuetemperatur (15 til 20 min), før du åbner det. Et koldt hætteglas og varm luft giver kondens indeni.
• LL-37 er et amfipatisk peptid. Ved længere tids opbevaring i opløsning kan det i mindre grad »klæbe« til hætteglassets glasvægge. Det er normalt; en forsigtig hvirvlende bevægelse frigør peptidet.
• Mørke er vigtigt. LL-37 indeholder ikke tryptofan (den mest følsomme aromatiske aminosyre), men det indeholder phenylalanin, som også reagerer på UV-lys. Opbevar det i et ravfarvet hætteglas eller en æske.
• Ryst ikke! Mekanisk stress kan forstyrre sekundærstrukturen og fremme aggregering (et typisk problem for amfipatiske peptider).
• Opløsningen skal forblive klar. Enhver uklarhed tyder på aggregering eller kontaminering; brug ikke en sådan prøve videre.
• Undgå gentagne fryse-tø-cyklusser. Hvis du rekonstituerer et større volumen, så del det i portioner (alikvoter) og frys dem én gang ved −20 °C eller −80 °C.

Kombinationer, peptider der ofte kombineres

LL-37 er først og fremmest et multifunktionelt peptid med både antimikrobielle og regenerative egenskaber. I forskningsprotokoller kombineres det med peptider, der supplerer bestemte mekanismer.

BPC-157 og TB-500, sårheling og regeneration

Den hyppigst nævnte kombination i forbindelse med forskning i heling af bløddele. BPC-157 fremmer i modeller neovaskularisering via VEGFR2 og modulerer NO-syntase. TB-500 (fragment af thymosin β4) fremmer cellemigration og remodellering af aktin. LL-37 bidrager med et antimikrobielt beskyttende miljø og EGFR-medieret keratinocytmigration. Tilsammen dækker de vaskularisering, cellemigration og antimikrobielt forsvar, tre nøglekomponenter i heling af kroniske sår.

KPV, antiinflammatorisk komponent i hudmodeller

KPV (Lys-Pro-Val, et tripeptidfragment af α-MSH) har i modeller udtalte antiinflammatoriske egenskaber via melanocortinsystemet og hæmning af NF-κB. Kombinationen med LL-37 diskuteres i forbindelse med modeller for atopisk dermatitis, hvor LL-37 skal bidrage med den antimikrobielle komponent og KPV dæmpe den kroniske inflammation. Ved psoriasis er situationen mere kompleks: KPV’s profil kunne være relevant, men LL-37 kan virke modsat (Lande 2007).

Thymosin α1, immunmodulerende synergi

Thymosin α1 er et peptid på 28 aminosyrer med kompleks immunmodulerende aktivitet, herunder støtte til modningen af T-celler og aktivering af dendritiske celler via TLR9. Kombinationen med LL-37 diskuteres i forskning i infektionsmodeller (sepsis, svære infektioner ved nedsat immunforsvar, visse virusinfektioner). Begge peptider modulerer det medfødte og det adaptive immunforsvar fra forskellige vinkler.

GHK-Cu, dermatologisk synergi

GHK-Cu (et tripeptid med bundet kobber) er velkarakteriseret inden for dermatologi og kosmetologi. Det stimulerer syntesen af kollagen og glykosaminoglykaner og fremmer remodelleringen af matrix. Kombinationen med LL-37 diskuteres i forbindelse med modeller for hudregenerering efter forbrændinger, aldringsforskning og arheling; publicerede studier af selve kombinationen er få. Mekanismerne supplerer hinanden: GHK-Cu på matrixniveau, LL-37 på niveauet for keratinocytter og antimikrobiel beskyttelse.

Yderligere bemærkning: forsigtighed i autoimmune modeller

I forskning i autoimmune sygdomme (psoriasis, lupus, visse former for IBD) frarådes det at kombinere LL-37 med andre immunaktivatorer. I disse modeller kan LL-37 bidrage til patogenesen via TLR9-IFN-α-sløjfen (Lande 2007). Kontrollér altid først, om LL-37 er egnet i den konkrete modelkontekst.

Vigtige videnskabelige data og citater

»LL-37, det eneste humane antimikrobielle peptid afledt af cathelicidin, udviser bredspektret antimikrobiel aktivitet og fungerer som et multifunktionelt effektormolekyle i det medfødte immunforsvar.«
Frit efter Dürr UH., Sudheendra US., Ramamoorthy A. (2006), Biochim Biophys Acta 1758(9), PubMed 16716248

Tal fra den prækliniske litteratur

• LL-37, det humane antimikrobielle cathelicidinpeptid, 37 aminosyrer, sekvens der begynder med Leu-Leu (deraf navnet), molekylvægt 4.493,3 Da
• Kodet af CAMP-genet (kromosom 3p21.3) og frigives fra proteinet hCAP-18 ved spaltning med proteinase 3 i neutrofiler
• Identificeret som FALL-39 af gruppen omkring Birgitta Agerberth (Karolinska Institutet, Sverige) i 1995
• Standardkoncentration i forsøg: 1–10 μg/ml in vitro i antimikrobielle assays (E. coli, S. aureus, C. albicans)
• Mekanisme: direkte permeabilisering af bakteriemembranen (kationisk amfipatisk α-helix), modulering af FPR2/ALX, P2X7 og GPCR’er, induktion af angiogenese og reepitelisering
• MIC mod E. coli: ~5 μM (Travis et al. 2000); mod S. aureus: ~10–20 μM
• Beslægtede antimikrobielle peptider i klinisk udvikling (pexiganan, omiganan, iseganan): ingen af dem har opnået godkendelse efter fase 2/3
• Over 3.000 publikationer i PubMed (1995–2024), et hjørnestenspeptid i det medfødte immunforsvar

Referencekilder (PubMed)

1. Agerberth B. et al. (1995). “FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis.” Proc Natl Acad Sci USA 92(1):195–199. PubMed 7529412
2. Dürr UH. et al. (2006). “LL-37, the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides.” Biochim Biophys Acta 1758(9):1408–1425. PubMed 16716248
3. Vandamme D. et al. (2012). “A comprehensive summary of LL-37, the factotum human cathelicidin peptide.” Cell Immunol 280(1):22–35. PubMed 23246832

Regulatorisk status: LL-37 er ikke et godkendt humant lægemiddel i nogen jurisdiktion (FDA, EMA eller nogen national lægemiddelmyndighed). Antimikrobielle peptider i udvikling (pexiganan/MSI-78, omiganan) gennemgik kliniske fase 2/3-forsøg til topiske anvendelser (diabetiske fodsår, rosacea), men opnåede ikke markedsføringstilladelse. De eksisterende data om selve LL-37 stammer overvejende fra præklinisk og in vitro-litteratur. Produktet sælges udelukkende til forskningsbrug (RUO) i videnskabelige laboratorier.

Ofte stillede spørgsmål om LL-37

Disse spørgsmål dækker de mest almindelige søgninger om LL-37 i forskningssammenhæng. Den fulde tekniske dokumentation finder du i afsnittene ovenfor.

Hvad er LL-37, og hvad bruges det til i forskningen?

LL-37 (sekvens LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES, 37 aa, 4.493 Da) er det eneste humane antimikrobielle cathelicidinpeptid og stammer fra forløberen hCAP-18. I forskningen udviser det direkte baktericid aktivitet (via permeabilisering af membranen), immunmodulation og effekter på sårheling i modeller. Det undersøges i modeller for kroniske infektioner, cystisk fibrose og dermatologiske sygdomme.

Hvilken dosis LL-37 bruger forskere i dyremodeller?

De anvendte mængder varierer betydeligt efter dyremodel, administrationsvej og formål, så der findes ingen standarddosis. In vitro arbejdes der typisk med koncentrationer i det mikromolære område (se tallene fra studierne ovenfor). For dyreforsøg henviser vi til metodeafsnittene i de enkelte publikationer; vi angiver ikke selv doser.

Hvad er forskellen på LL-37 og Thymosin α1?

LL-37 og Thymosin α1 er begge immunmodulerende peptider, men LL-37 er rettet mod direkte antimikrobielt forsvar (medfødt immunitet, baktericid aktivitet), mens Thymosin α1 modulerer den adaptive immunitet via T-celler og TLR-signalering. LL-37 har en iboende baktericid aktivitet, det har Thymosin α1 ikke.

Er LL-37 et godkendt lægemiddel eller et forskningsstof?

LL-37 er ikke et godkendt humant lægemiddel. Beslægtede peptider (LL-37-derivatet OP-145 og omiganan) har gennemgået fase 2/3-forsøg, men ingen af dem har opnået godkendelse fra EMA eller FDA. Produktet sælges udelukkende til forskningsbrug (RUO) i videnskabelige laboratorier, ikke til klinisk brug.

Hvordan opbevares LL-37?

Frysetørret LL-37 bør opbevares ved −20 °C beskyttet mod lys med en holdbarhed på 2 år; ved 2 til 8 °C 18 måneder. LL-37 er amfipatisk; rekonstituer det i sterilt eller bakteriostatisk vand uden detergenter, og opløsningen er stabil i 30 dage ved 2 til 8 °C. Undgå gentagne fryse-tø-cyklusser.

Hvad er halveringstiden for LL-37, og hvor ofte administreres det i studier?

LL-37 har en kort plasmahalveringstid (ca. 30 minutter) på grund af hurtig proteolyse. I væv (hvor det er bundet til biofilm eller cellemembraner) varer effekten i timevis. Administrationshyppigheden varierer mellem de enkelte modeller og fremgår af metodeafsnittene i de konkrete studier.

Hvor kan jeg købe LL-37 i EU til videnskabelig forskning?

I EU tilbyder Molequa® LL-37 til videnskabelig forskning. Til Danmark leverer vi med FedEx direkte til døren, typisk inden for 3 til 5 hverdage og uden told, da forsendelsen sker inden for EU. Produktet leveres frysetørret med deklareret renhed ≥ 99 %; analysecertifikatet fra Analyton Labs offentliggøres med den første batch, og status for certifikatet finder du på produktsiden. Produktet er udelukkende til forskningsbrug (RUO) i videnskabelige laboratorier.