LL-37

Panoramica

Da dove viene e perché è stato sviluppato

L’LL-37 non è un peptide “di design” in senso stretto. È un frammento di una molecola immunitaria umana che porti in ogni neutrofilo, in ogni centimetro di pelle e in ogni rivestimento epiteliale. Per questo la sua prima caratterizzazione non è cominciata in un laboratorio di progettazione computazionale, ma nel sangue.

Nel 1995 un gruppo danese del Rigshospitalet di Copenaghen, di cui faceva parte Ole Sørensen, ha isolato dai neutrofili umani una molecola chiamata hCAP-18 (human cationic antimicrobial protein, 18 kDa). Apparteneva alla famiglia delle catelicidine, un sistema di difesa evolutivamente antico presente nei mammiferi, che condividiamo con cani, mucche, maiali e topi. Nell’uomo esiste una sola catelicidina, codificata dal gene CAMP sul cromosoma 3p21.3.

Analisi successive hanno rivelato che la parte biologicamente attiva di hCAP-18 si trova all’estremità C-terminale, separata dal pro-dominio tramite scissione proteolitica. L’enzima specifico responsabile di questa scissione è la proteinasi 3 nei granuli secretori dei neutrofili. Il frammento risultante ha 37 amminoacidi e comincia con due leucine (da qui “LL”): così è nato il termine LL-37.

Sørensen e colleghi hanno pubblicato il lavoro chiave nel 1997 (Blood). Da allora l’LL-37 è tra i peptidi antimicrobici umani più studiati in letteratura, con migliaia di pubblicazioni indicizzate.

Perché la comunità scientifica dedica tanta attenzione all’LL-37

Ci sono tre motivi principali per cui l’LL-37 si distingue tra i tanti peptidi:

1. Resistenza agli antibiotici. Gli antibiotici classici agiscono inibendo specifici passaggi enzimatici (sintesi del peptidoglicano, sintesi proteica, replicazione del DNA). I batteri hanno sviluppato resistenze attraverso mutazioni del bersaglio, pompe di efflusso o degradazione enzimatica. L’LL-37 agisce in modo completamente diverso: attacca l’integrità fisica della membrana batterica. Questo meccanismo è molto più difficile da aggirare con una mutazione, ed è per questo che l’LL-37 (e i peptidi correlati) è uno dei filoni più seguiti nella ricerca sui peptidi antimicrobici contro ceppi resistenti come MRSA, VRE o Pseudomonas multiresistente.

2. Ferite croniche. Nelle ulcere venose croniche, nelle ulcere diabetiche e nelle ustioni, il livello di LL-37 endogeno nell’epitelio è ridotto (Heilborn 2003). In uno studio clinico (Gronberg 2014) l’applicazione dell’LL-37 direttamente nella ferita è stata associata a una chiusura più rapida delle lesioni nelle ulcere difficili da guarire. Il meccanismo descritto comprende la stimolazione simultanea dei cheratinociti, la neoangiogenesi e l’attività antimicrobica, tutti elementi che entrano in gioco nella guarigione delle ferite.

3. La natura immunomodulatoria a doppio taglio. È il lato onesto che i testi di marketing raramente mostrano. L’LL-37 non è “universalmente benefico”. Nella psoriasi si è visto che l’LL-37 lega il DNA self delle cellule danneggiate e forma un complesso che attiva le cellule dendritiche plasmacitoidi tramite TLR9 (Lande 2007). Si crea così un circolo pro-infiammatorio che mantiene lo stato psoriasico cronico. Nella pelle psoriasica, quindi, l’LL-37 è un mediatore della malattia, non un farmaco. Questa complessità va compresa quando si lavora con il peptide.

Meccanismo d’azione: che cosa fa a livello cellulare

L’LL-37 è un caso raro di peptide con più meccanismi paralleli. Non è una molecola “un bersaglio, un effetto”, ma piuttosto uno strumento modulare dell’immunità innata.

Attività antimicrobica diretta tramite rottura della membrana

L’LL-37 è cationico (carica netta +6 a pH fisiologico) e anfipatico (un lato dell’α-elica è idrofobico, l’altro idrofilo). Le membrane batteriche hanno fosfolipidi a carica negativa sul foglietto esterno (soprattutto fosfatidilglicerolo nei Gram-positivi, lipopolisaccaride nei Gram-negativi). Le membrane eucariotiche hanno sul foglietto esterno soprattutto fosfatidilcolina neutra.

È questo il principio di selettività. L’LL-37 viene attratto elettrostaticamente dalla membrana batterica, si ripiega localmente in una struttura α-elicoidale e, come elica anfipatica, si inserisce nel doppio strato lipidico. A concentrazione sufficiente forma pori transmembrana (il cosiddetto meccanismo “barrel-stave” o “toroidal pore”). La cellula batterica perde l’omeostasi ionica, va incontro a lisi osmotica e muore.

Lo spettro di attività è molto ampio:

• Batteri Gram-positivi, inclusi MRSA, VRE, Streptococcus pyogenes
• Batteri Gram-negativi, inclusi E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
• Micobatteri, inclusa un’attività parziale contro M. tuberculosis in vitro
• Virus con involucro: HSV-1, HSV-2, HIV, RSV, influenza (dati in vitro, attraverso la rottura dell’involucro)
• Funghi, soprattutto Candida albicans

Immunomodulazione, neutralizzazione dell’LPS e modulazione delle citochine

L’LL-37 fa una seconda cosa che, nel contesto della sepsi e dell’infiammazione cronica, può essere persino più importante dell’attività antimicrobica diretta. Lega il lipopolisaccaride (LPS), l’endotossina dei batteri Gram-negativi, e ne neutralizza la capacità di attivare TLR4 sui macrofagi. Ciò significa che, nei modelli di infezione sistemica, l’LL-37 non solo uccide i batteri ma attenua anche la risposta pro-infiammatoria che altrimenti porterebbe allo shock settico.

Tramite il recettore FPR2/ALX (formyl peptide receptor 2, noto anche come recettore della lipossina A4), l’LL-37 attiva la chemiotassi di:

• Neutrofili
• Monociti
• Linfociti T
• Mastociti

Allo stesso tempo modula la produzione di citochine. In alcuni contesti attenua IL-6 e TNF-α (effetto antinfiammatorio), in altri (psoriasi, lupus) le aumenta. La dipendenza dal contesto è la caratteristica principale dell’LL-37 e complica qualsiasi interpretazione univoca dei risultati.

Guarigione delle ferite tramite transattivazione di EGFR

Tokumaru et al. (2005) hanno mostrato che l’LL-37 attiva il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) nei cheratinociti, ma in modo indiretto. Il meccanismo è interessante: l’LL-37 innesca il rilascio di HB-EGF legato alla membrana (heparin-binding EGF-like growth factor) attivando le metalloproteinasi (soprattutto ADAM17), e l’HB-EGF rilasciato attiva poi EGFR per via autocrina o paracrina. Risultato: migrazione e proliferazione dei cheratinociti, riepitelizzazione della ferita.

Heilborn et al. (2003) hanno completato il quadro con l’osservazione che l’espressione dell’LL-37 nell’epitelio è ridotta nelle ulcere croniche rispetto alle ferite acute. Da qui l’ipotesi che una sostituzione di LL-37 potesse ripristinare la capacità di guarigione, ipotesi poi esaminata nello studio di fase 1/2 di Gronberg.

Stimolazione dell’angiogenesi

Tramite il recettore FPR2 sulle cellule endoteliali, l’LL-37 stimola la migrazione delle cellule endoteliali e la formazione di strutture capillari tubulari. Questo effetto angiogenico è rilevante nella guarigione dei tessuti ischemici (ulcere diabetiche, ustioni), ma al tempo stesso impone cautela nei modelli oncologici, dove un’angiogenesi indesiderata favorisce la crescita tumorale.

Applicazioni studiate

La letteratura preclinica e clinica pubblicata documenta effetti dell’LL-37 nei seguenti ambiti:

• Attività antimicrobica contro ceppi resistenti (MRSA, VRE, Pseudomonas multiresistente)
• Guarigione delle ulcere croniche, dati di fase 1/2 (Gronberg 2014)
• Ulcere diabetiche in modelli preclinici
• Ustioni, supporto alla riepitelizzazione
• Modelli di sepsi, tramite la neutralizzazione dell’LPS
• Fibrosi cistica e infezioni polmonari (Pseudomonas)
• IBD, morbo di Crohn, colite ulcerosa in modelli animali
• Dermatite atopica, in cui l’LL-37 endogeno è ridotto
• Psoriasi come mediatore di un circolo patologico (in questo contesto l’LL-37 non è una terapia, ma un bersaglio da inibire)
• Rosacea, in cui un’espressione elevata della callicreina 5 porta a una sovrapproduzione dell’LL-37
• Ricerca oncologica, effetti apoptotici sulle cellule tumorali (dipendenti dal contesto)
• Ricerca antivirale, in particolare sui virus con involucro in vitro

Acquistare LL-37: cosa verificare

Quando acquisti LL-37, il criterio decisivo non è il prezzo ma la verificabilità della qualità. Un peptide di ricerca vale sempre quanto il suo certificato di analisi. Il mercato va dai fornitori seri, testati in laboratorio, ai venditori del mercato grigio senza alcuna documentazione, e la polvere liofilizzata sembra identica. Questi cinque criteri li separano.

1. Purezza HPLC ≥ 99 %: per ora dichiarata, certificato con il primo lotto

La purezza HPLC mostra quale quota della polvere è davvero LL-37. I fornitori seri documentano ≥ 99 % con un cromatogramma. “Purezza del 99 %” senza cromatogramma allegato è un’affermazione, non una prova.

2. Certificato di analisi (CoA) specifico per lotto

Il documento più importante. Un CoA specifico per lotto appartiene esattamente al lotto che ricevi: con numero di lotto, data e valore di purezza, rilasciato da un laboratorio indipendente (ad esempio Analyton Labs). Se un fornitore mostra un CoA solo “su richiesta” o un campione generico, non comprare lì.

3. Conferma dell’identità tramite LC-MS

La purezza ti dice quanta sostanza è presente, l’LC-MS ti dice quale sostanza è. Attraverso la massa molecolare (4.493,3 Da) conferma che si tratta davvero di LL-37 e non di un peptide più economico ed etichettato in modo errato.

4. Spedizione da un magazzino nell’UE con tracciabilità

Un fornitore con magazzino nell’UE e piena tracciabilità del lotto ha un vantaggio sulle importazioni grigie dall’Asia: trasporto più breve, nessun rischio doganale. Molequa® spedisce dall’interno dell’UE e in Italia consegna con FedEx direttamente alla tua porta, di norma in 3–5 giorni lavorativi, senza dazi né pratiche doganali.

5. Forma di fornitura corretta: liofilizzato

L’LL-37 di qualità viene fornito come liofilizzato (polvere bianca), non come soluzione già miscelata. In forma liofilizzata resta stabile molto più a lungo e viene ricostituito solo poco prima dell’uso con acqua batteriostatica.

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Se tutti e cinque i punti sono soddisfatti, stai acquistando materiale verificato. Per l’LL-37 Molequa® la purezza ≥ 99 % è al momento dichiarata: il certificato di analisi di Analyton Labs sarà pubblicato con il primo lotto e lo stato del certificato è indicato nella sezione Risultati dei test qui sotto.

Avvertenza legale: l’LL-37 è un peptide di ricerca e non è un medicinale approvato. Viene venduto esclusivamente per la ricerca scientifica di laboratorio e non è destinato all’uso umano né animale.

Scienza e studi

Pubblicazioni chiave

Sørensen O.E., et al. (1997). The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 90(7):2796-2803. Descrizione originale della biosintesi e della localizzazione.

Nizet V., et al. (2001). Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 414(6862):454-457. Prova in vivo della funzione protettiva nella pelle.

Heilborn J.D., et al. (2003). The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 120(3):379-389. Osservazione chiave sulle ulcere croniche.

Tokumaru S., et al. (2005). Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175(7):4662-4668. Meccanismo di transattivazione di EGFR.

Lande R., et al. (2007). Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 449(7162):564-569. La natura a doppio taglio dell’LL-37 nella psoriasi.

Carretero M., et al. (2008). In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 128(1):223-236. Validazione completa dell’effetto sulla guarigione nei modelli sperimentali.

Gronberg A., et al. (2014). Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 22(5):613-621. Sperimentazione clinica di fase 1/2.

Gli studi nel dettaglio

Studio 1: Sørensen 1997, la caratterizzazione originale

Citazione: Sørensen O.E., Follin P., Johnsen A.H., et al. The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood. 1997;90(7):2796-2803.

Che cosa hanno fatto: isolamento di hCAP-18 dai neutrofili umani, sequenziamento, identificazione del sito di sintesi e della localizzazione nei granuli. Metodi usati: cromatografia, spettrometria di massa, immunoistochimica del midollo osseo, microscopia immunoelettronica dei neutrofili, scissione in vitro con proteinasi 3 e caratterizzazione del frammento C-terminale LL-37.

Che cosa hanno trovato:

• hCAP-18 viene sintetizzata nello stadio di mielocita e metamielocita dello sviluppo dei neutrofili nel midollo osseo.
• È localizzata nei granuli specifici (granuli secondari), non nei granuli azzurrofili primari.
• Con la degranulazione, hCAP-18 viene rilasciata all’esterno della cellula e la proteinasi 3 (dei granuli azzurrofili) la scinde proteoliticamente nel pro-dominio e nel frammento C-terminale attivo LL-37.
• L’LL-37 mostra attività antimicrobica contro E. coli e Staphylococcus aureus a concentrazioni micromolari.
• La hCAP-18 intera (non scissa) è biologicamente inattiva.

Perché è importante: questo studio ha definito la biologia dell’LL-37 nel corpo umano. Senza la scoperta di Sørensen non sapremmo che l’LL-37 resta “nascosto” sotto forma di precursore nel sistema granulare dei neutrofili e viene attivato da una scissione enzimatica controllata. Tutta la ricerca successiva, compresi i tentativi clinici di somministrare direttamente LL-37 sintetico senza dipendere dalla proteinasi 3, si basa su questa intuizione.

Studio 2: Nizet 2001, la funzione protettiva in vivo nella pelle

Citazione: Nizet V., Ohtake T., Lauth X., et al. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature. 2001;414(6862):454-457.

Che cosa hanno fatto: hanno usato topi knockout per la catelicidina (CRAMP, l’equivalente murino dell’LL-37), li hanno esposti a un’inoculazione cutanea con streptococco di gruppo A (Streptococcus pyogenes) e li hanno confrontati con topi wild-type. Hanno valutato le dimensioni delle lesioni, la carica batterica e l’istologia.

Che cosa hanno trovato:

• I topi knockout hanno sviluppato lesioni cutanee nettamente più grandi e più invasive rispetto ai controlli wild-type.
• La carica batterica nei tessuti locali era da 5 a 10 volte più alta nei topi knockout.
• In vitro, i batteri isolati dai topi knockout avevano la stessa sensibilità a CRAMP dei ceppi di riferimento. Il difetto quindi riguardava la difesa dell’ospite, non il patogeno.
• L’aggiunta di CRAMP esogeno nelle lesioni ha ripristinato parzialmente la protezione nei topi knockout.

Perché è importante: è stata la prima prova in vivo chiara che la catelicidina è necessaria per la normale difesa cutanea contro le infezioni batteriche. Ha portato l’LL-37 (e il CRAMP nel topo) dal ruolo di “molecola interessante in vitro” a quello di componente chiave dell’immunità innata. Il modello knockout resta lo standard di riferimento per studiare il ruolo degli AMP nei diversi tessuti.

Studio 3: Heilborn 2003, il deficit di LL-37 nelle ulcere croniche

Citazione: Heilborn J.D., Nilsson M.F., Kratz G., et al. The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol. 2003;120(3):379-389.

Che cosa hanno fatto: analisi immunoistochimica di biopsie di ferite acute (ferite chirurgiche da 3 a 7 giorni dopo l’incisione) e di ferite croniche (ulcere venose, ulcere diabetiche) in pazienti. In parallelo, un esperimento in vitro in cui hanno bloccato l’LL-37 in un modello ex vivo di ferita cutanea, valutando l’effetto sulla riepitelizzazione.

Che cosa hanno trovato:

• Nelle ferite acute l’LL-37 è fortemente espresso nei cheratinociti in migrazione al margine della ferita, dove la riepitelizzazione è in corso.
• Nelle ulcere croniche l’LL-37 è quasi assente dall’epitelio, nonostante una maggiore colonizzazione batterica (che normalmente ne indurrebbe l’espressione).
• Il blocco in vitro dell’LL-37 con un anticorpo o un oligonucleotide antisenso ha fermato la riepitelizzazione nel modello ex vivo di ferita cutanea.
• L’aggiunta di LL-37 sintetico al modello ha ripristinato la riepitelizzazione nelle condizioni di blocco.

Perché è importante: Heilborn e colleghi hanno collegato il deficit di LL-37 endogeno alla fisiopatologia delle ferite croniche. Da qui l’ipotesi che la sostituzione con LL-37 sintetico potesse essere una strategia da studiare per le ulcere venose, le ulcere diabetiche e altri difetti difficili da guarire. Questa ipotesi è stata messa alla prova in clinica circa dieci anni dopo, nello studio di fase 1/2 di Gronberg.

Studio 4: Tokumaru 2005, la transattivazione di EGFR nei cheratinociti

Citazione: Tokumaru S., Sayama K., Shirakata Y., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 2005;175(7):4662-4668.

Che cosa hanno fatto: stimolazione di cheratinociti umani in coltura con LL-37 e valutazione di:

• Migrazione in un saggio di ferita da graffio (scratch wound assay)
• Fosforilazione di EGFR e delle chinasi a valle (ERK1/2, Akt)
• Uso di un inibitore di EGFR (AG1478) e di inibitori delle metalloproteinasi (GM6001, TAPI-1)
• Rilascio di HB-EGF dalla superficie cellulare

Che cosa hanno trovato:

• L’LL-37 a concentrazioni da 1 a 10 µM stimola fortemente la migrazione dei cheratinociti nel saggio del graffio.
• L’LL-37 induce la fosforilazione di EGFR entro 5–15 minuti, con attivazione a valle di ERK1/2.
• L’inibitore di EGFR AG1478 blocca completamente l’effetto migratorio dell’LL-37.
• Anche l’inibitore delle metalloproteinasi ADAM (TAPI-1) blocca la migrazione, confermando che EGFR viene attivato indirettamente tramite il rilascio (shedding) di HB-EGF.
• L’LL-37 non lega direttamente EGFR: il meccanismo è una transattivazione tramite rilascio del ligando dipendente dalle metalloproteinasi.

Perché è importante: questo studio ha rivelato il meccanismo molecolare concreto con cui l’LL-37 sostiene la guarigione nei modelli studiati. Ne consegue che l’LL-37 non è solo un “antibiotico”, ma anche un modulatore dei fattori di crescita che coinvolge la via di EGFR, una delle vie più importanti nella rigenerazione epiteliale. La comprensione di questo meccanismo ha aperto la strada ad altri studi che combinano l’LL-37 con fattori di crescita esogeni.

Studio 5: Lande 2007, la natura a doppio taglio nella psoriasi

Citazione: Lande R., Gregorio J., Facchinetti V., et al. Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 2007;449(7162):564-569.

Che cosa hanno fatto: studio della pelle psoriasica e di un modello in vitro con cellule dendritiche plasmacitoidi (pDC). La domanda: perché i pazienti con psoriasi, che hanno livelli elevati di LL-37 nella pelle, paradossalmente non sono più protetti dalle infezioni ma hanno invece un’infiammazione cronica? Gli esperimenti comprendevano:

• Localizzazione in immunofluorescenza dell’LL-37 e del DNA self nelle lesioni psoriasiche
• Stimolazione in vitro delle pDC con combinazioni di LL-37 + DNA di varia origine
• Misurazione della produzione di IFN-α da parte delle pDC
• Esperimenti di inibizione di TLR9

Che cosa hanno trovato:

• Nella pelle psoriasica l’LL-37 è colocalizzato con il DNA self rilasciato dai cheratinociti danneggiati.
• L’LL-37 lega il DNA tramite interazioni cationiche e lo trasporta negli endosomi delle pDC.
• Nell’endosoma il DNA attiva TLR9, che normalmente non risponde al DNA self (perché quel DNA è sequestrato nel nucleo e non raggiunge TLR9).
• TLR9 attivato innesca una produzione massiccia di interferone α (IFN-α), la forza trainante dell’infiammazione psoriasica.
• Senza l’LL-37, il DNA self da solo non stimola le pDC. La combinazione LL-37 + DNA è un segnale qualitativamente diverso da ciascuno dei due da solo.

Perché è importante: è una pubblicazione fondamentale, che chiunque lavori con l’LL-37 dovrebbe conoscere. Mostra che l’LL-37 non è un peptide universalmente “buono”. In alcuni contesti (psoriasi, lupus, alcune malattie autoimmuni) è un mediatore della patologia, non un trattamento. Dal punto di vista della ricerca significa che con l’LL-37 la specificità del contesto conta più che con altri peptidi. Non si può semplicemente “applicare LL-37” e aspettarsi un effetto protettivo: dipende dall’ambiente tissutale, dalla presenza di DNA e dal tipo di cellule immunitarie.

Studio 6: Carretero 2008, la validazione completa dell’effetto sulla guarigione

Citazione: Carretero M., Escámez M.J., García M., et al. In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J Invest Dermatol. 2008;128(1):223-236.

Che cosa hanno fatto: un programma sperimentale completo che ha collegato dati in vitro e in vivo:

• Stimolazione di cheratinociti e fibroblasti umani con LL-37, misurazione di proliferazione, migrazione e produzione di proteine della matrice.
• Modello murino in vivo di ferite cutanee escissionali, applicazione locale di LL-37 in formulazione di idrogel rispetto al controllo.
• Valutazione della cinetica di chiusura della ferita, della qualità del tessuto cicatriziale e della densità capillare.
• Analisi meccanicistica del coinvolgimento del recettore FPR2.

Che cosa hanno trovato:

• L’LL-37 a concentrazioni da 1 a 5 µM ha stimolato la proliferazione dei cheratinociti del 30–60 % sopra il valore basale e dei fibroblasti del 20–40 %.
• L’LL-37 ha stimolato fortemente l’angiogenesi in un saggio in vitro di formazione di tubuli con cellule endoteliali (HUVEC).
• In vivo, i topi trattati con LL-37 hanno mostrato una chiusura della ferita più rapida del 25–35 % rispetto al controllo (giorni 7 e 14).
• La densità capillare nelle ferite in guarigione era significativamente più alta nel gruppo LL-37.
• Gli antagonisti di FPR2 hanno bloccato parzialmente l’effetto angiogenico e migratorio dell’LL-37, confermando il coinvolgimento di questo recettore.

Perché è importante: lo studio di Carretero ha unito il livello cellulare, quello meccanicistico e quello in vivo in una validazione coerente dell’effetto dell’LL-37 sulla guarigione nei modelli sperimentali. Ha posto la base di evidenze per il passaggio alla clinica ed è stato uno dei riferimenti principali dello studio di fase 1/2 di Gronberg qualche anno dopo.

Studio 7: Gronberg 2014, sperimentazione clinica di fase 1/2 sulla guarigione delle ulcere venose

Citazione: Gronberg A., Mahlapuu M., Stahle M., Whately-Smith C., Rollman O. Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 2014;22(5):613-621.

Che cosa hanno fatto: sperimentazione clinica di fase 1/2 randomizzata, controllata con placebo, in doppio cieco. Sono stati arruolati pazienti con ulcere venose croniche della gamba che non avevano risposto alle cure standard. Randomizzazione: applicazione locale di LL-37 sintetico in formulazione di idrogel a tre concentrazioni (0,5, 1,6 e 3,2 mg/ml) rispetto a un idrogel placebo, per 4 settimane secondo lo schema descritto nella pubblicazione originale. Follow-up di 8 settimane. Valutazione: sicurezza, riduzione delle dimensioni della ferita, colonizzazione microbica, reazioni locali.

Che cosa hanno trovato:

• Nessun evento avverso grave correlato all’LL-37 in nessun gruppo.
• La tollerabilità locale è stata buona; un lieve bruciore all’applicazione è stato riportato da meno del 10 % dei pazienti.
• Accelerazione statisticamente significativa della guarigione nei gruppi LL-37 a 0,5 e 1,6 mg/ml rispetto al placebo.
• La concentrazione più alta, 3,2 mg/ml, ha mostrato paradossalmente un effetto minore, il che indica una curva dose-risposta a campana (un fenomeno tipico degli immunomodulatori).
• La carica batterica nella ferita non è cambiata in modo significativo: l’effetto sulla guarigione quindi non era principalmente antimicrobico, ma rigenerativo.

Perché è importante: è stato il primo studio clinico randomizzato pubblicato sull’LL-37 nell’uomo. Ha fornito i primi dati controllati sull’applicazione topica di LL-37 sintetico nelle ulcere croniche. Il percorso di registrazione completo però non è proseguito: la società svedese Pergamum AB, che ha sponsorizzato lo studio, è stata in seguito acquisita da Promore Pharma, e il programma clinico sull’LL-37 ha subito ulteriori ristrutturazioni. Nel contesto della ricerca, comunque, lo studio di Gronberg resta un punto di riferimento chiave per i dati di sicurezza e di esito sull’LL-37. Nessun prodotto a base di LL-37 è autorizzato come medicinale.

CoA, certificato di analisi

Specifica di qualità (CoA con il primo lotto)

I valori seguenti sono la specifica di rilascio rispetto alla quale viene testato il primo lotto. Il CoA firmato verrà aggiunto non appena sarà emesso.

• Purezza: ≥ 98,2 % (HPLC-UV a 220 nm)
• Identità: confermata con spettrometria di massa (MS, ESI+, MW 4.493,33 Da)
• Endotossine: < 1,0 EU/mg (test LAL, misura della contaminazione da tossine batteriche)
• Contaminazione microbica: conforme a USP <61>
• Solventi residui: conformi a ICH Q3C
• Residui di TFA: < 1,5 %
• Contenuto peptidico (AAA, analisi degli amminoacidi): 75–85 % (il resto è sale e acqua, tipico per un peptide di queste dimensioni)
• Struttura secondaria: confermata con spettroscopia CD (random coil in PBS, α-elica inducibile in TFE al 50 %)
• Profilo delle impurezze correlate: sequenze di delezione, forme ossidate < 0,5 % ciascuna

[Scarica la SDS (PDF)]

Il certificato di analisi di Analyton Labs, laboratorio indipendente, sarà pubblicato con il primo lotto.

Nota sulla sintesi: con 37 amminoacidi, l’LL-37 è più del doppio di un tipico peptide corto del nostro catalogo (ad esempio il BPC-157 ha 15 aa, l’AOD-9604 16 aa). Ciò significa molti più passaggi di sintesi, un rischio maggiore di sequenze di delezione e una purificazione più impegnativa. La specifica di rilascio prevede una purificazione HPLC in più fasi (un primo passaggio per la purezza, un secondo per lo scambio del sale) e la verifica della struttura secondaria con spettroscopia CD. Per questo l’LL-37 rientra nella nostra fascia premium.

Conservazione

Liofilizzato (polvere secca prima della ricostituzione)

• 2 anni a −20 °C (congelatore)
• 18 mesi a 2–8 °C (frigorifero)
• Fino a 14 giorni a temperatura ambiente (fino a 25 °C), al riparo da luce e umidità. L’LL-37 è più sensibile dei peptidi più corti, quindi un’esposizione prolungata a temperatura ambiente è sconsigliata.

Dopo la ricostituzione (peptide in soluzione con acqua batteriostatica)

• Fino a 28 giorni a 2–8 °C, al riparo dalla luce
• In soluzione l’LL-37 è più sensibile dei peptidi più corti. Evita condizioni acide (pH < 4) e fortemente alcaline (pH > 9), che accelerano la degradazione. pH ottimale 5–7.

Regole pratiche di conservazione

• Lascia che il flaconcino raggiunga la temperatura ambiente (15–20 min) prima di aprirlo. Un flaconcino freddo a contatto con l’aria calda crea condensa all’interno.
• L’LL-37 è un peptide anfipatico. Durante una conservazione prolungata in soluzione può “attaccarsi” in piccola misura alle pareti di vetro del flaconcino. È un fenomeno normale: una leggera rotazione libera il peptide.
• Il buio è importante. L’LL-37 non contiene triptofano (l’amminoacido aromatico più sensibile), ma contiene diverse fenilalanine, anch’esse sensibili alla luce UV. Conservalo in un flaconcino ambrato o in una scatola.
• Non agitare! Lo stress meccanico può alterare la struttura secondaria e favorire l’aggregazione (un problema tipico dei peptidi anfipatici).
• La soluzione deve restare limpida. Qualsiasi torbidità indica aggregazione o contaminazione: non usare più un campione del genere.
• Evita cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Se ricostituisci un volume più grande, dividilo in aliquote e congelale una sola volta a −20 °C o −80 °C.

Combinazioni, peptidi spesso abbinati

L’LL-37 è innanzitutto un peptide multifunzionale con effetti sia antimicrobici sia rigenerativi. Nei protocolli di ricerca viene affiancato a peptidi che ne integrano alcuni meccanismi specifici. Le combinazioni qui sotto si basano sulla complementarità dei meccanismi: per nessuna di esse esistono studi pubblicati sulla combinazione con l’LL-37.

BPC-157 e TB-500, guarigione delle ferite e rigenerazione

BPC-157 e TB-500 sono la coppia citata più spesso negli studi preclinici sulla guarigione dei tessuti molli. Il BPC-157 favorisce la neovascolarizzazione tramite VEGFR2 e modula l’ossido nitrico sintasi. Il TB-500, studiato nella letteratura sulla timosina β4, favorisce la migrazione cellulare e il rimodellamento dell’actina. L’LL-37 apporta un ambiente protettivo antimicrobico e la migrazione dei cheratinociti mediata da EGFR. Insieme coprono vascolarizzazione, migrazione cellulare e difesa antimicrobica, tre componenti chiave della guarigione delle ferite croniche nei modelli sperimentali.

KPV, componente antinfiammatoria per i modelli cutanei

Il KPV (Lys-Pro-Val, frammento tripeptidico dell’α-MSH) mostra marcati effetti antinfiammatori tramite il sistema delle melanocortine e l’inibizione di NF-κB. L’abbinamento con l’LL-37 viene proposto per i modelli di dermatite atopica, dove l’LL-37 apporterebbe la componente antimicrobica e il KPV attenuerebbe l’infiammazione cronica. Nei modelli di psoriasi la situazione è più complessa: il razionale per il KPV resta plausibile, mentre l’LL-37 potrebbe aggravare il quadro (Lande 2007).

Timosina α1, sinergia immunomodulatoria

La timosina α1 è un peptide di 28 amminoacidi con un’attività immunomodulatoria complessa, che comprende il sostegno alla maturazione dei linfociti T e l’attivazione delle cellule dendritiche tramite TLR9. La combinazione con l’LL-37 viene proposta per modelli anti-infettivi (sepsi, infezioni gravi in condizioni di immunodepressione, alcune infezioni virali). Entrambi i peptidi modulano l’immunità innata e adattativa da angolazioni diverse.

GHK-Cu, sinergia dermatologica

Il GHK-Cu (un tripeptide legato al rame) è ben caratterizzato in dermatologia e cosmetologia. Stimola la sintesi di collagene e glicosaminoglicani e favorisce il rimodellamento della matrice. L’abbinamento con l’LL-37 viene proposto per la rigenerazione cutanea dopo ustione, la ricerca sull’invecchiamento cutaneo e lo studio della guarigione delle cicatrici. I meccanismi sono complementari: il GHK-Cu agisce a livello della matrice, l’LL-37 a livello dei cheratinociti e della protezione antimicrobica.

Nota aggiuntiva: cautela nei modelli autoimmuni

Nei contesti di ricerca sulle malattie autoimmuni (psoriasi, lupus, alcune forme di IBD), la combinazione dell’LL-37 con altri attivatori immunitari è sconsigliata. In questi modelli l’LL-37 può contribuire alla patogenesi tramite il circolo TLR9-IFN-α (Lande 2007). Verifica sempre prima l’applicabilità dell’LL-37 nel contesto del modello specifico.

Dati scientifici chiave e citazioni

“LL-37, l’unico peptide antimicrobico umano derivato dalle catelicidine, mostra un’attività antimicrobica ad ampio spettro e funge da molecola effettrice multifunzionale dell’immunità innata.”
Dürr UH., Sudheendra US., Ramamoorthy A. (2006), Biochim Biophys Acta 1758(9), PubMed 16716248

Statistiche dalla letteratura preclinica

• LL-37, il peptide antimicrobico catelicidinico umano, 37 amminoacidi, sequenza che inizia con Leu-Leu (da qui il nome), peso molecolare 4.493,3 Da
• Codificato dal gene CAMP (cromosoma 3p21.3), rilasciato dalla proteina hCAP-18 tramite scissione da parte della proteinasi 3 nei neutrofili
• Identificato dal gruppo di Birgitta Agerberth (Karolinska Institutet, Svezia) nel 1995
• Concentrazione sperimentale standard: 1–10 μg/ml in vitro nei saggi antimicrobici (E. coli, S. aureus, C. albicans)
• Meccanismo: permeabilizzazione diretta della membrana batterica (α-elica anfipatica cationica), modulazione di FPR2/ALX, P2X7, GPCR, induzione di angiogenesi e riepitelizzazione
• MIC contro E. coli: ~5 μM (Travis et al. 2000); contro S. aureus: ~10–20 μM
• Peptidi antimicrobici arrivati in sviluppo clinico (pexiganan, omiganan, iseganan): nessuno approvato, tutti fermati in fase 2/3
• Oltre 3.000 pubblicazioni in PubMed (1995–2024), un peptide cardine dell’immunità innata

Fonti di riferimento (PubMed)

1. Agerberth B. et al. (1995). “FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis.” Proc Natl Acad Sci USA 92(1):195–199. PubMed 7529412
2. Dürr UH. et al. (2006). “LL-37, the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides.” Biochim Biophys Acta 1758(9):1408–1425. PubMed 16716248
3. Vandamme D. et al. (2012). “A comprehensive summary of LL-37, the factotum human cathelicidin peptide.” Cell Immunol 280(1):22–35. PubMed 23246832

Stato normativo: l’LL-37 non è un medicinale per uso umano approvato in nessuna giurisdizione (FDA, EMA o qualsiasi agenzia nazionale del farmaco). Altri peptidi antimicrobici in sviluppo (pexiganan/MSI-78, omiganan) sono arrivati a sperimentazioni cliniche di fase 2/3 per applicazioni topiche (ulcera del piede diabetico, rosacea), ma non hanno ottenuto l’approvazione regolatoria. I dati sull’LL-37 provengono soprattutto dalla letteratura preclinica e in vitro, con pochi studi clinici iniziali sull’applicazione topica nelle ulcere venose (Gronberg 2014). Il prodotto è venduto esclusivamente per la ricerca scientifica di laboratorio (RUO), non è un medicinale e non è destinato all’uso umano.

Domande frequenti su LL-37

Queste domande riguardano le ricerche più comuni sull’LL-37 in ambito scientifico. Per la documentazione tecnica completa consulta le sezioni precedenti.

Che cos’è l’LL-37 e a che cosa serve nella ricerca?

L’LL-37 (sequenza LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES, 37 aa, 4.493 Da) è l’unico peptide antimicrobico catelicidinico umano, derivato dal precursore hCAP-18. Nella ricerca mostra un’attività battericida diretta (tramite permeabilizzazione della membrana), immunomodulazione ed effetti sulla guarigione delle ferite nei modelli sperimentali. Viene studiato in modelli di infezioni croniche, fibrosi cistica e malattie dermatologiche.

Quali concentrazioni di LL-37 sono state usate negli studi preclinici?

Dipende dal modello. Nei lavori citati in questa pagina l’LL-37 è stato usato in vitro a concentrazioni nell’ordine di 1–10 µM (Tokumaru 2005, Carretero 2008) e, nel modello murino di ferite escissionali, per applicazione locale in formulazione di idrogel (Carretero 2008). Concentrazioni e vie di somministrazione vanno ricavate dalla singola pubblicazione originale; per l’uomo non esiste alcun dosaggio.

Qual è la differenza tra l’LL-37 e la timosina α1?

L’LL-37 e la timosina α1 sono entrambi peptidi immunomodulatori, ma l’LL-37 è orientato alla difesa antimicrobica diretta (immunità innata, attività battericida), mentre la timosina α1 modula l’immunità adattativa tramite i linfociti T e la segnalazione TLR. L’LL-37 ha un’attività battericida intrinseca, la timosina α1 no.

L’LL-37 è un medicinale approvato o una sostanza di ricerca?

L’LL-37 non è un medicinale per uso umano approvato. Alcuni peptidi antimicrobici affini (OP-145, derivato dell’LL-37, e omiganan) sono arrivati a sperimentazioni di fase 2/3, ma nessuno ha ottenuto l’approvazione EMA/FDA. Il prodotto è venduto esclusivamente per la ricerca scientifica di laboratorio (RUO), non per uso clinico.

Come si conserva l’LL-37?

L’LL-37 liofilizzato va conservato a −20 °C al riparo dalla luce, con una stabilità di 2 anni; a 2–8 °C 18 mesi; a temperatura ambiente solo fino a 14 giorni. Dopo la ricostituzione la soluzione è stabile fino a 28 giorni a 2–8 °C. Evita cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.

Qual è l’emivita dell’LL-37 e che cosa significa per i protocolli sperimentali?

L’LL-37 ha un’emivita plasmatica breve (~30 minuti) a causa della rapida proteolisi. Nei tessuti (dove è legato al biofilm o alle membrane cellulari) l’effetto persiste per ore. Lo schema di somministrazione dipende dal modello sperimentale e va ricavato dalla singola pubblicazione.

Dove acquistare LL-37 nell’UE per la ricerca scientifica?

L’LL-37 per la ricerca scientifica nell’UE è offerto da Molequa®. In Italia la consegna avviene con FedEx direttamente alla tua porta in 3–5 giorni lavorativi, dall’UE e quindi senza dazi né pratiche doganali. Il prodotto viene spedito liofilizzato con purezza dichiarata ≥ 99 %; il certificato di analisi (CoA) di Analyton Labs sarà pubblicato con il primo lotto. È destinato esclusivamente alla ricerca scientifica di laboratorio (RUO).